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1、单克隆抗体的研究进展摘要：单克隆抗体近年来发展迅速，并广泛应用于医学，生物学，免疫学等多种学科。单抗药物可用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病，尤其是用于治疗肿瘤，已显示出良好的前景。本文参阅近 10 年国内外相关文献，并进行整理，综述单克隆抗体的研究进展，着重阐述用于治疗肿瘤的单克隆抗体应用中存在的问题、解决方法以及研究的展望。关键词：单克隆抗体；抗肿瘤药物；治疗单抗药物治疗疾病具有明确的靶向性，作用机制明确，因而具有起效快、疗效好、副作用小等优点。尤其是对肿瘤的治疗，能克服化疗药物不能有效区分正常细胞和肿瘤细胞、副作用大等缺点。同时，单克隆抗体体积小，能更有效地透入肿瘤；分子小、
2、消除快、累积毒性小；所携带的弹头脱离后，可较快被清除；循环中免疫靶向结合物对靶细胞的竞争作用小；半衰期短；穿透性好；能穿过血脑屏障，因而还可以作为新一代靶向载体。与化学药物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化诱导剂、光敏剂、酶等物质构成单克隆抗体靶向药物，把杀伤肿瘤细胞的活性物质特异的输送到肿瘤部位，利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别，从而把药物直接导向肿瘤细胞，提高药物疗效，降低药物对循环系统及其他部位的毒性 1。1 作用机制目前，单抗的作用机制并不十分明确，通过研究，目前认为有阻断作用、信号传导作用以及靶向作用等三种作用机制 1。1.1 阻断作用 现用于临床的大部分未偶联
3、单抗主要用于自身免疫和免疫抑制，是通过阻断和调节作用完成的。几乎在所有的单抗应用中，通常是通过阻断免疫系统的一种重要的胞桨或受体-配体相互作用而实现的。另一种相类似的阻断活性可能存在于单抗的抗病毒感染中，通过阻断和抵消病原体的进入和扩散表现出对机体的防御功能，短期给予单抗后可取得长期疗效。肿瘤细胞生长、扩增和分化，需要各种生长因子的持续性刺激，而这些生长因子也参与肿瘤的侵润、转移和血管生成，单克隆抗体与其受体结合，可抑制配体- 受体的相互作用，从而使得这些肿瘤细胞得不到生长因子的刺激而自行死亡。贝伐单抗通过结合VEGF 受体，阻断 VEGR 与受体的结合，抑制内皮细胞增殖或者血管生成，抑制病灶
4、转移 2。1.2 信号传导作用 许多抗癌单抗是通过恢复效应因子，直接启动信号机制而获得细胞毒效应的。对 Trastuzumab 而言，单抗结合可诱导一系列在肿瘤生长控制中起作用的信号传递，该抗原是生长因子受体家族的一个成员，能提供重要的有丝分裂信号，其单抗似乎能阻断与促进肿瘤生长有关的重要的配体受体相互作用 3。1.3 靶向作用 单抗靶向肿瘤细胞的首要目的是产生肿瘤特异性反应物，然后由免疫系统中的活化因子将其消灭。但现在对体内的抗体效应因子作用机制发挥程度还不清楚，也不清楚能否作用于大量肿瘤细胞。2 单克隆抗体药物应用现状单抗药物一般分为：治疗疾病（尤其是肿瘤）的单抗药剂、抗肿瘤单抗偶联物、治
5、疗其他疾病的单抗。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。如：最早被美国 FDA 批准用于治疗肿瘤的单抗药物利妥昔单抗。抗肿瘤单抗偶联物，或称免疫偶联物（Immunoconjugate）由单抗与有治疗作用的物质（如：放射性核素、毒素和药物等）两部分构成，其中包括放射免疫偶联物、免疫毒素、化学免疫偶联物，此外还有酶结合单抗偶联物、光敏剂结合单抗偶联物等 4。化学药物与单抗相结合的偶联物，作用于病变区域，不但提高药物的疗效，而且还能降低药物对各脏器组织的细胞毒性。单抗与放射性同位素的偶联物，即放射免疫偶联物，其与化学药物连接在一起，起一种双“弹头”的靶向作用，从而增强对肿瘤细胞
6、的杀伤效应、提高对肿瘤细胞的细胞毒性。毒素与单抗的偶联物，免疫毒素来源于植物或细胞毒素由于有强烈的毒性很难作为治疗剂使用，但毒素与单抗的偶联物可在动物模型中显示疗效。单抗由于具有诸多优点，在疾病的治疗中发挥了重要的作用。在恶性肿瘤治疗方面，无论是单抗为主，还是单抗耦联放射性物质、化疗药物等的免疫治疗，都取得了较好的效果。在其他疾病（如过敏性疾病、感染性疾病、炎症性疾病、器官移植、自身免疫性疾病等）以及一些临床上疑难病的治疗上也取得了新的进展，使疾病的治疗有了更广的选择性，不再局限于原有药物的治疗，特别是人源化程度较好的抗体的使用，已大大减少了异源性反应 5。3 单抗应用中存在的问题及解决途径单
7、抗药物的临床研究结果已展示出良好的前景,但仍有些问题需要进一步研究解决。单抗药物存在的问题主要涉及免疫学和药理学两方面：3.1 免疫学方面问题主要是人抗鼠抗体(HAMA)反应。因为多年来用于临床研究的单抗药物多数使用小鼠单抗制备,往往导致 HAMA 反应。此外，肿瘤细胞群体在抗原性方面的异质性，可能影响单抗药物的疗效。 Maki Goto等 6研究发现 在单抗治疗结直肠癌之前，患者的血清中就有 HAMA 相关反应，临床医师在使用抗体治疗时应该警惕 HAMA 表达的可能性。 对于免疫学方面的问题，仍有许多需要研究的地方，现在解决的方法一般是降低药物的免疫原性，主要途径是使鼠源性单抗人源化或研制完
8、全的人源抗体。单抗人源化主要通过基因工程技术制备嵌合抗体或改形抗体，嵌合抗体是将 Fc 段置换为人源性，其它部分仍为鼠源性。改形抗体是指除互补决定区(CDR)为鼠源性外，其它部分均为人源性。临床研究表明，嵌合抗体的副反应轻，HAMA 反应率较鼠源性单抗低，在血中半衰期也较长。3.2 药理学方面的问题主要是到达作用部位的药量不足。单抗药物具有体内分布特异性，但有研究表明，能到达作用部位的药物量仍属有限。据推算，肿瘤组织的单抗摄取量约为 0.005% (注入剂量/ 克组织) ，说明可到达靶部位的药物量甚少。单抗药物在体内运送过程受多种因素影响。由于它是异体蛋白，会被网状内皮系统摄取，有相当数量将积
9、聚于肝、脾和骨髓。单抗药物是大分子物质，通过毛细血管内皮层以及穿透肿瘤细胞外间隙均受到限制。此外，部分偶联药物分子质量过大，难于透过毛细管内皮层和穿过肿瘤细胞外间隙进入肿瘤深部滞留，也是一个急需解决的问题。解决方法主要是提高单抗药物在作用部位的浓度。第一，为提高药物在肿瘤的浓度,单抗药物分子的小型化是研制的重要途径。使用抗体片段，如Fab、双特异性抗体（bsAbs） 、单链可变区片段(scFvs)制备分子量较小的偶联物，可能提高对细胞外间隙的穿透性，增加到达深部肿瘤细胞的药物量 7。 第二，采用局部注射。据报道， Jamerson SC 等 8采用玻璃体内注射贝伐单抗，用于治疗假性脑瘤，发现颅
10、内压下降，并且脉络膜新生血管减少。此外，抗血管生成内皮生长因子药物(anti-VEGF) 的玻璃体内注射广泛用于治疗年龄相关性黄斑病变（AMD）和其他疾病的脉络膜新生血管，并且有良好的效果 9。第三，利用药物制剂新技术，研究增加药物在作用部位的浓度。抗体药物也是属于蛋白类，注射给药后，由于肾的滤过，抗体和细胞的识别，以及物理降解，使得药物在体内迅速清除掉。PEG 与化合物相连，能够增加血清半衰期，减少免疫原性并增加生物利用度。如果将 PEG 与抗体或者抗体片段连接，将有可能延长药物在体内的循环时间。近年来，一些研究人员对 scFv, Fab 等抗体片段进行 PEG 化修饰，scFv 的 PEG
11、 化能降低 mAbs 的免疫原性，简化单抗的生产的步骤，PEG-scFv 共轭物具有与 mAbs 不同的清除速率和途径 10。基于这点，新的可释放的 PEG 化设计可能用于抗体药物 11。单抗药物在体内半衰期短，需要重复给药，从而限制了它的使用，理想的释放模型是，先快速释药，然后以一个比较稳定的速率恒定释药。研究表明，脂质体具有缓释作用，能够缓慢释放，延缓肾排泄和代谢，从而延长作用时间；同时能够降低药物毒性，提高稳定性，如可提高胰岛素脂质体、疫苗等的稳定性。脂质体已经广泛应用于蛋白多肽类的药物，但是对单抗的给药系统研究很少，目前报道的有 Majid Abrishami 等 12用脂质体包载贝伐
12、单抗，用于玻璃体内注射给药，与市售制剂相比，使得半衰期延长，曲线下面积是后者的 1.5 倍，同时也降低了毒副作用。但是，使用脂质体包载单抗的包封率很低，只有 40%左右，这将成为脂质体用于单抗给药系统的一个瓶颈，需要进一步地探索。4 展望抗肿瘤单抗药物研究经历了比较曲折的发展过程。80 年代迅猛发展，90 年代初期一度处于低谷，以至近年再度成为生物技术药物领域研究的热点。单抗药物研究的发展趋势具有以下特点：4.1 单抗的人源化及小型化1975 年分子生物学家 G.J.F.克勒和 C.米尔斯坦在细胞杂交技术的基础上，创建杂交瘤技术，实现了结构、氨基酸顺序、特异性等都一致的单抗（McAb）大量 地
13、、高滴度地、均一地生产。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的，从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，使得单抗的在很多疾病的诊断和治疗中，有着不可替代的优势。但是第一代单抗（英文名后缀是：-momab，如Ibritumomab,Tositumomab）是鼠源的，会引发人体抗鼠单抗免疫反应(HAMA)，引起严重的安全性问题，并限制了单抗的药效。为了克服这个缺点，人们制备了人鼠嵌合单抗(后缀: -ximab, 如: Cetuximab)。它是鼠 mAbs 的恒定区基因被人 Abs 的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码产生的单克隆抗体 13。这样既能保持鼠单抗的特性，又降低了
14、单抗在人体内的免疫反应。这种单抗大约有 1/3 是鼠源，仍有引起潜在的免疫原性的可能，因此，人源化的单抗(后缀: -zumab，如：trastuzumab, matuzumab)发展起来。人源化单抗大概含有 10%的鼠可变区片段，也能诱导免疫原性，但是并不会完全地排除。为了能使单克隆抗体大量的应用于疾病治疗、临床试验和科研中，我们不仅要降低其免疫原性，还要对其亲和力、质量、治疗能力强弱等方面提更高的要求。目前，研究人员已建立多种方法生产完全人源性抗体(后缀: -mumab, 如:panitumumab, zalutumumab)，主要有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术和核糖体展示技术 14。这种
15、完全人源化的单抗具有最小的免疫原性或者根本没有免疫原性 15。近年来，随着抗体基因结构的阐明，DNA 重组及转基因技术开始用于抗体的改造，抗体的研发进入了第 3 代，即基因工程抗体时代，如人源化抗体、单链抗体、抗体片段（包括抗原结合片断（Fab） 、可变区片段(Fv)、单链可变区片段 (ScFv)、小分子抗体、某些特殊类型抗体（双特异抗体、免疫脂质体）及抗体融合蛋白（免疫毒素、免疫粘连素）等。与第 2 代单抗相比，基因工程抗体免疫原性低、特异性高、穿透力强，并且可以大量表达，大大降低了生产成本 16。4.2 偶联物分子的小型化及修饰 庞大的偶联物分子难以通过毛细管内皮层和细胞外间隙到达实体瘤深
16、部的肿瘤细胞。因此，研制小型化单抗药物对提高疗效有重要意义。通过酶切方法可得到单抗 (Fab)2 或 Fab 片段，其相对分子质量分别相当于原抗体的 2/3 和 1/3 左右。通过基因工程技术制备的 Fv 片段或单链抗体 scFv，相对分子质量约相当于抗体的 1/6。研究表明， Fab 片段较易穿透细胞外间隙到达深部的肿瘤细胞 17。使用上述小型化抗体制成的单抗药物,在药代动力学方面将具有新特点，并可能减少或推迟人体的抗体反应。分子的小型化无疑是研制高效单抗药物的一条重要途径。4.3 寻找新的靶点目前，在临床应用和已进入临床试验阶段的单克隆抗体抗肿瘤药，根据其作用靶位不同被分成 7 类，分别为人类表皮生长因子受体（Human epidermal growth factor receptor，HER） 、细胞分化抗原（Cluster of differentiation，CD）20、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor
