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1、十、动物组织中五氯酚残留量测定的标准操作程序气相色谱质谱法1 适用范围及检出限本方法规定了猪肉、鸡肉等动物组织中五氯酚的气相色谱质谱仪测定。本方法适用于猪肉、鸡肉等动物组织中五氯酚含量的测定。当动物肌肉取5.0g,最终定容0.5mL 时,本方法五氯酚定量限为1.0g/kg,检出限为0.3g/kg。2 原理猪肉、鸡肉等动物组织加入内标后,经5%三氯乙酸沉淀,正己烷-乙酸乙酯溶液提取,SLC 柱净化,乙酸酐-吡啶溶液衍生成五氯苯乙酸酯,气相色谱-质谱法测定,内标法定量。3 试剂3.1 SLC 固相萃取柱: 500mg/6mL(杭州福裕科技服务有限公司)。3.2 正己烷:色谱纯。3.3 乙酸乙酯:色
2、谱纯。3.4 乙酸酐:分析纯。3.5 吡啶:分析纯。3.6 丙酮:色谱纯。3.7 无水硫酸钠:分析纯。3.8 五氯酚标准储备液(100g/mL,甲醇):购自农业部环境保护科研监测所,编号GSB05-1850-2008,0-4冰箱放置,有效期1 年。3.9 五氯酚标准使用液(1.0g/mL):取0.25mL 标准储备液用色谱纯丙酮稀释25mL,得到1.0g/mL 使用液,放置4冰箱。3.10 2,4- 二溴酚内标液(10.0g/mL) : 称取2,4-二溴酚标准品0.05g,用色谱纯丙酮溶解定容到50mL,得到1.0mg/mL 内标储备液,经丙酮逐级稀释至浓度10.0g/mL,放置4冰箱。3.1
3、1 提取液:乙酸乙酯:正己烷=1:1(V:V)。3.12 衍生提取液: 乙酸乙酯:正己烷=1:4(V:V)。3.13 衍生化试剂:乙酸酐:吡啶=1:1(V:V)现配现用。3.14 0.2mol/L 碳酸钾溶液:称取2.76g 碳酸钾溶于重蒸水 ,并定容于100mL。4 仪器与耗材4.1 气相色谱质谱仪。4.2 匀浆机(IKA)。4.3 氮吹仪。4.4 10 mL 具塞玻璃刻度试管、离心管。4.5 固相萃取仪。4.6 冷冻离心机:最大转速12000rpm 以上。5 色质谱条件5.1 DB-5MS 毛细管色谱柱: 30 m0.25 mm(内径)0.25 m(膜厚)。5.2 进样口温度:230。5.
4、3 柱温:初温80,保持2 min,以10min 升至250,290后运行4min。5.4 载气:氦气,纯度99.999,流速为1.0 mL/min 。5.5 进样量:1L。5.6 电离方式:EI 源,70eV。5.7 离子源温度:230。5.8 进样方式:不分流进样。5.9 五氯苯乙酸酯标准保留时间及监测离子见附录表1,总离子流图见图1。6 样品处理6.1 样品采集和保存采集猪肉、鸡肉等动物组织样品(肥瘦各半),用绞肉机绞碎后装塑料瓶内后-20 冻藏,检测前解冻。6.2 提取称取5.00g 样品入离心管内,加入30 l 10.0g/mL 2,4-二溴酚内标液、20 mL 5%三氯乙酸溶液,匀
5、浆1 min,再加入10 mL 提取液,斡旋提取2 min,然后012000 rpm 离心4 min,吸出上层有机相入具塞试管内,在60水浴内氮气吹干,加入2mL 乙腈超声溶解,3000 rpm 离心4 min,乙腈相待净化。6.3 净化取SLC 柱( 500 mg/6 mL),加0.2 g 无水硫酸钠,用4 mL 乙腈淋洗活化柱子,然后将上述乙腈相加到柱子上,并收集,再用4 mL 乙腈洗脱收集,洗脱液60氮气吹干, 残余物待衍生。6.4 衍生上述残余物中加1.0 mL 衍生提取液溶解,再加衍生液0.1 mL,密封,于60水浴反应15 min,取出冷却,加碳酸钾溶液2.0mL,充分混匀,静置分
6、层,取有机相,供气相色谱质谱测定。7 计算取10L、25L、50L、100L、200L 1.0mg/L1.0g/mL 五氯酚标准使用液,分别加入30 l 10.0 g/mL 2,4-二溴酚内标液、1.0 mL 衍生提取液、0.1 mL 衍生液,密封,同样品一起衍生,获得10g/L - 200g/L 五氯酚标准曲线。根据标准曲线计算样品中五氯酚的含量C。样品中五氯酚含量按如下公式计算,结果保留三位有效数字。X=C *1/m式中:X 实际样品中五氯酚含量,g/kg;转化成五氯酚钠乘以系数 1.08;C 仪器测定样品中五氯酚含量,g/L ;m 取样量,g8 数据处理根据五氯苯乙酸酯保留时间及碎片离子进行定性、定量分析。图 2 五氯苯乙酸酯质量色谱图9 分析方法质量控制9.1 质谱定性按照欧盟规定,定量离子和定性离子比例在要求范围之内,保留时间定性时间窗口一般为0.02 min。9.2 为了保证分析结果的准确,要求在分析每批样品时,进行加标试验,五氯酚肉样加标5.0 g/kg,五氯酚添加回收率应在70-120%范围之内。