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1、1肺表面活性蛋白 B 在新生儿呼吸窘迫综合征中的作用【关键词】 肺表面活性蛋白 B 新生儿 呼吸窘迫综合征新生儿呼吸窘迫综合征（respiratory distress syndrome of newborn，NRDS）是引起新生儿呼吸衰竭的主要疾病，也是新生儿特别是早产儿死亡的主要原因。其发病主要机制是由于缺乏肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS ） ，导致肺泡表面张力增加，肺泡塌陷。临床医学、流行病学及生物化学都充分证明 NRDS是一种多因素、多基因疾病13 。目前认为 NRDS 与 PS 中肺表面活性物质蛋白（surfactant protein，SP）合成减少
2、有很大的关系，表面活性蛋白B （SPB ）是其中最重要的一种，直接发挥降低肺泡表面张力的作用4 。近年来，一些 SP 的遗传性变异，尤其是 SPB基因变异，已被证实是 NRDS 病因中的危险因子58 。国外研究发现新生儿 SPB减少或缺陷与某些基因突变相关9 。1 肺表面活性物质PS 是指分布于肺泡内具有降低气液界面表面张力的物质，主要由肺泡型上皮细胞合成，具有高度表面活性，存在于被覆肺泡表2面的液体中。其主要生理功能是降低肺泡表面张力，维持肺泡结构之间的相对稳定，调节肺顺应性，防止肺泡萎陷和肺水肿。PS 为磷脂蛋白复合物，其中磷脂约占 90%，主要存在形式为二棕榈酰卵磷脂（dipalmito
3、yl phosphatidylcholine，DPPC ）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG） ，对降低肺泡表面张力有重要作用。PS 中与磷脂分子相互作用的特异性蛋白质称为 SP，约占 8%10%。迄今为止已发现 4 种 SP，根据发现的顺序命名为SPA、SPB 、SPC 、SPD 4 种亚型。其中，SPA 、SPD 为大分子亲水性 SP，SPB 、SPC 为小分子疏水性 SP，它们是 PS降低肺泡表面张力的必需物质。SP 促进磷脂向液体表层分布并扩散，疏水性 SPB、SPC 功能最强，能独立发挥生理效应，且与 SPC相比，SPB 作用更强。2 SPB的分子生物学特性
4、及生理功能2.1 SPB 分子生物学特性SPB基因（SFTPB）位于人类第 2 号染色体短臂，约 9.5 kb，由 11 个外显子和 10 个内含子组成，第 11 外显子是不可译的。SFTPB 编码 2kb mRNA 转录物，该转录物在去除 23 个氨基酸组成的第一信号肽后被翻译成含 381 个氨基酸的 SPB前体蛋白（precursor protein，proSPB ） ，分子量约 42kDa。proSPB3具有一个典型的疏水性起始序列，使之能顺利通过内质网孔进入加工处理过程。第 129131和 311313位氨基酸经糖基化作用，N末端糖基化位点被 g.1580CT 清除，使 131 位苏氨
5、酸被异亮氨酸取代，再经过由组织蛋白酶 H 及其它蛋白参与的一系列蛋白水解过程，去除 C、N 末端的氨基酸，最终形成只有 79 个氨基酸的成熟 SPB，由第 67 外显子编码10，11 。SPB的表达具有组织细胞特异性，主要在肺泡 型细胞合成和分泌，是以同源二聚体形式存在的疏水性蛋白，由二硫化物连接 2条含有 79 个氨基酸残基的多肽链组成。每条多肽链含有 3 个二硫化物桥：Cys8Cys77 、Cys11Cys71 、Cys25Cys46 ，每个多肽链的 Cys48 形成链间二硫键，可维持 SPB稳定性。每个 SPB分子拥有 45 个两亲性的 螺旋结构区，成双反向平行排列， SPB分子带正电荷
6、。成熟 SPB合成后贮存于板层体，其疏水面富含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，可与磷脂膜相互作用，共同进入分泌途径。2.2 SPB 生理功能SPB的主要生理作用为促进磷脂在肺泡表面形成稳定的单分子层，从而降低肺泡表面张力、防止呼气末肺泡塌陷、增加肺顺应性、促进肺间质液体回流。仅含有 SPB和脂质的表面活性物质可以改4善 PS 缺失肺的压力 容积曲线，并能有效治疗 NRDS 动物模型的PS 缺失。2.2.1 促进 PS 中磷脂吸附 在呼吸过程中，PS 磷脂必须快速附着于气液界面并扩展形成单分子膜，才能发挥降低肺泡表面张力的作用。而 SPB最重要的功能之一就是促进 PS 磷脂在气液界面的吸附和扩展。SP
7、B 的同源二聚体特性及 螺旋结构使其能够与磷脂层结合：SPB 分子中亲水性的正电荷基团与磷脂分子首端的极性基团相互作用，而疏水性基团与磷脂分子疏水性的酰基端链相互作用，从而使磷脂在气液平面迅速扩展，加速处于液下相中的磷脂混合物在液气界面形成单分子膜，提高肺表面活性磷脂降低表面张力的作用。SPB 的碱性残基在与负离子磷脂的相互作用中也发挥着重要作用，使 SPB还能够促进不饱和磷脂，如 PG，从磷脂单分子膜中挤出（Squeezeout ） ，从而使单分子膜中的 DPPC 进一步纯化而更为浓缩，增强磷脂膜的表面活性。若在体外实验中加入抗SPB的单克隆抗体，可显著抑制 PS 的快速吸附，使表面张力增加
8、。体内实验也显示，给小鼠注射 SPB单克隆抗体，或给新生兔气管内滴注 SPB单抗，均可引起严重肺损伤和呼吸衰竭，而给予非特异性抗血清则不引起肺损害。因此，SPB 对于 PS 系统发挥其正常的表面活性功能不可缺少。2.2.2 参与 PS 在肺泡内的组装和转化 肺泡腔内 PS 主要有四种5结构形式，即板层体（Lamellar body，LB） 、管髓体（Tubular myelin，TM） 、单分子层及大小不等的单层或多层囊泡，这一排列顺序可能就是 PS 在肺泡内的转化过程：PS 由肺泡型上皮细胞合成后，以 LB 形式贮存于细胞内。LB 以出胞方式分泌入肺泡，在肺泡表面液体层中转换成高度有序呈网格
9、状的 TM，后者进而在肺泡的液气界面上形成具有表面活性的磷脂单分子层。继之膜纯化、崩溃为囊泡样结构。因此，TM 是表面单分子层的前体。 TM 形成障碍必将影响 PS 发挥其正常的表面活性功能。SPB 不仅在表面单分子膜的形成中有重要作用，而且在 LB 转化为 TM 的过程中也是不可缺少的。体外实验显示，将 SPA、SPB 、Ca2+ 与磷脂（DPPC 和甘油磷脂）混合孵育时，可产生典型 TM 样网状结构，若除去SPA或 SPB，则不能形成 TM 样结构，若只加 SPA，而无SPB，则只能形成膜外有 8 m微粒附着的双层脂膜，表明 SPB是 TM 形成的必需成分。SPB 基因缺失鼠的肺内无 TM
10、，进一步说明 SPB在此方面的重要性。2.2.3 SPB 促进型肺泡上皮细胞对磷脂脂质体的摄取 其作用机制不详。但对 SPC摄取却起抑制作用，提示 SPB和 SPC在维持气液界面表面活性方面可能起协同作用。SPB 还可作用于肺泡巨噬细胞的氧化亚氮合成酶，使其水平下降，能减少脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞产生氧化亚氮。63 SPB缺失3.1 SPB基因表达的调节SP 基因属发育控制基因家族，在人类妊娠前 3 月胎肺中，SPB基本不表达，在妊娠 1518 周时，气管、支气管上皮细胞即可见 SPB mRNA 和表达蛋白，此后呈进行性增加；在妊娠1324 周内，Northern 印记分析表明 SPB增加达成
11、年肺的50%。在妊娠后 3 月内， SPB mRNA 及其表达蛋白水平与 PS 磷脂水平升高平行，合成分泌增加，羊水中可检出这些蛋白。人类 SPB基因启动子为111bp 73bp ，结构复杂，其中结合有甲状腺转录因子1 （TTF1 ）和肝细胞核因子32 （HNF32 ） 。SPB启动子活性依赖于各种因子对启动子上游和下游区的相互作用。TTF1 作为特异性转录因子，能进入核内结合 SPB基因上游顺式作用元件而实现对 SPB基因表达调控。 TTF1通过基序CTNNAGTCAAG连接到 DNA 结合位点。TTF1 结合位点的突变可阻碍 TTF1重组体与 DNA 结合，从而显著抑制 SPB启动子活性，
12、以致 SPB蛋白合成减少。 HNF32也有促进启动子的作用。核因子B （NFB ）结合位点突变可引起 SPB启动子活性降低40%。7SPB基因表达也受一些体液因素的调节。 SPB基因中（G/C）GGT（A/T ）CA（A/C）NNTGT （C/T）CT 片段是可与糖皮质激素受体结合的共同序列，称为糖皮质激素反应元件（GRE） 。SPB基因在 5端侧序列的 700 bp 内含有 4 个 GRE。糖皮质激素对 SPB有单相上调作用，在人胎肺移植培养中能刺激 SPB mRNA 表达增强，在 H820 核 H441 细胞系中也有相似结果。SP基因中 CTGACGTCAG 片段是与 cAMP 调控作用有
13、关的共同序列，成为 cAMP 反应元件（ CRE） 。SPB 基因的第 1 内含子中有CRE，cAMP 对 SPB表达主要是抑制作用。视黄酸（retinoic acid，RA）能促进 SPB mRNA 的生成及量的增加12 。目前，大多数研究均支持 RA 能够上调 SPB基因表达，具体通过RARAR轴这一信号途径直接作用于 SPB基因。而且，RA 还可以通过增强 mRNA 的稳定性、减慢降解速率来提高 mRNA 的水平12 。而具有强烈致炎效应的肿瘤坏死因子 （TNF ）可降低人肺腺癌细胞系中 SPB mRNA 水平，具有效量依赖关系。TNF的抑制性作用与经蛋白激酶 C 依赖通路的作用一致。有
14、文献报道，TNF 对 SPB mRNA 表达的抑制是通过基因 3端非翻译区的顺式作用序列介导的13 。3.2 SPB基因突变Nogee 发现新生儿 SPB减少或缺失不仅与肺发育程度相关，8也与基因结构变异有关8 。SPB 等位基因具有多态性，其突变率为百万分之三，某些特异位点突变可造成 SPB蛋白合成障碍。通过采用基因克隆和 DNA 测序等基因分析技术，发现这些基因突变主要分布在 SPB基因的前 9 个外显子上，以第 2、4 、7 外显子分布尤甚，主要包括无义密码子、错义、移码和剪接位点突变。最常见的突变是 1981 年 Teja K 等首先发现的位于 SFTPB 第 4 外显子的 1549C
15、GGA（121ins2） 。这种突变的频率是 1/1 0001/3 000，约 70% SPB缺失病例与其有关 8，15 。这种突变导致移码并在第 6 外显子产生提前终止翻译的密码子，生成一种易变 RNA转录物，使 proSPB及成熟 SPB缺乏，并引起 SPC前体蛋白的不完全表达14，15 。然而，121ins2 突变不是 SPB缺失的唯一原因。近年来，许多学者对 SPB基因突变进行了大量研究。目前已发现 30 多种引起部分或完全 SPB缺失的隐性功能缺失性突变8，1422 。Balland 等17发现在第 7 外显子上存在点突变（ R236C）Arg236Cys（CGCTGC ） ，这种突变没有影响转录或 mRNA 的稳定性，但降低了 SPB的翻译效率和（或）改变了初始翻译产物的加工，从而使 SPB含量减少。Nogee 等8通过对 32 个患SPB缺失婴儿的两对等位基因进行检测，发现了 15 种 SPB基因突变。同时还发现第 9 外显子包含一些同源序列（ CCCTG 和 TG A/G A/G G/T A/C） ，它们可能与一些小的插入和缺失有关。另一9常见无义突变位于第 4 外显子 g.1580，使第 131 密码子中异亮氨酸取代苏氨酸，清除 5端糖基化位点23 。Daniel J Wegner
