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1、1羊膜移植促进兔角膜碱烧伤愈合的作用【摘要 】 目的观察羊膜移植(AMT) 在兔角膜碱烧伤早期对角膜上皮愈合、角膜炎症反应和新生血管生成的影响。方法新西兰白兔建立角膜碱烧伤模型,烧伤后 30 min 实施手术，随机分为碱烧伤组(A)、新鲜羊膜移植组(fAMT)、保存羊膜移植组(pAMT)，设对照组(C)。病理组织学观察角膜,计算机图像分析系统计数角膜多形核中性白细胞(PMN)和微血管数量, 发色底物法检测角膜组织浸液中组织型纤溶酶原激活剂(tPA) 和 1 型纤溶酶原激活剂抑制剂 (PAI1)活性。结果 fAMT 和 pAMT 组较 A 组同期角膜上皮修复快，角膜 PMN 数及微血管数量明显减
2、少(P0.01)，tPA/PAI1 显著下降(P0.01)；fAMT 组 tPA/PAI1 低于 pAMT 组(P0.05)。结论羊膜移植在角膜碱烧伤早期治疗中具有较强的促进上皮修复、减轻炎症反应和减少新生血管生成的作用。新鲜羊膜移植效果优于保存羊膜。 【关键词】 羊膜 角膜 烧伤 化学 碱类 眼烧伤羊膜位于胎盘最内层,无血管、神经和淋巴,光滑而有弹性,是人体最厚的基底膜。近年来,人们发现羊膜具有抑制炎症、新生血管生成2及促进上皮细胞修复重建眼表的作用。笔者通过建立兔角膜碱烧伤模型, 分析羊膜移植促进角膜碱烧伤愈合的作用,为临床治疗角膜化学烧伤等疾病提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.
3、1.1 动物及分组新西兰白兔 60 只,体质量(2.30.18)kg,雌雄不限, 健康无眼病 无锡市惠山江南实验动物场提供,许可证号:SCXK( 苏)20020006。随机分成碱烧伤组(A)、新鲜羊膜移植组(fAMT)、保存羊膜移植组(pAMT) 及对照组(C)。模型组每组 18 只, 对照组 6 只,右眼为实验眼。1.1.2 仪器与试剂眼科显微手术器械(江苏省康明医疗器械有限公司),手术双目显微镜、显微镜(日本 Olympus 公司), 摄像机(日本Panasonic 公司), 彩色图像分析仪(Image 8000，澳大利亚),ImagePlus 5.0 图像分析软件 ,低温冰箱(德国 Si
4、emens 公司),匀浆器(美国 Wheaton 公司 ),高速低温离心机(日本 Hitachi 公司), 酶联免疫检测仪(550 型,美国 Metertech 公司),tPA 及总 PAI1 活性测定试剂盒(上海太阳生物技术公司) 。31.2 方法1.2.1 兔角膜碱烧伤模型制备 1%戊巴比妥钠 40 mg/kg 兔耳缘静脉麻醉,1%的卡因眼液滴右眼表面麻醉,置开睑器,直径 8 mm 圆形单层滤纸片置于 1 mol/L NaOH 溶液浸至饱和，取出置兔角膜中央1 min,使角膜达到 度烧伤1 。立即用生理盐水 100 mL 冲洗结膜囊。氯霉素眼液及阿托品眼液滴眼。fAMT 组和 pATM 组
5、 30 min后手术。1.2.2 羊膜制备羊膜均取自产前血清学检查 HIV、HBV、HCV 及梅毒螺旋体均阴性的健康产妇剖宫产的胎盘。无菌条件下生理盐水冲洗胎盘表面血迹,浸泡于含 5104 U/L 青霉素、 5104 U/L 链霉素和 2.5 mg/L 两性霉素 B 的无菌生理盐水 10 min。fAMT 组:从绒毛膜上钝性分离羊膜,上皮面向上平铺于粘贴手术巾的纸片上,剪成4.0 cm4.0 cm,4 保存于无菌 DMEM 液中 ,12 h 内使用。pAMT组: 羊膜置于装有无菌 DMEM 与 100%甘油(11 混合)的无菌瓶中,-80 冻存。1.2.3 羊膜移植解冻取出羊膜,在含 40 万
6、 U/L 庆大霉素的无菌生理盐水中复温 30 min。沿角膜缘 360环形剪开球结膜,将备好的新鲜或保存的羊膜片剪成直径 18 mm 圆形,上皮面朝上平铺于角膜表面, 边缘超出角膜缘 2 mm,用 80 无损伤缝线间断缝合固定于浅层4巩膜, 使羊膜紧帖角膜创面, 剪去多余的羊膜,结膜缝回角膜缘。术后结膜囊涂金霉素眼膏,每日滴氯霉素眼液 2 次, 涂 1%阿托品眼膏及金霉素眼膏各 1 次。1.2.4 标本制备分别于角膜碱烧伤后 14,30,60 d 各组随机取 6 只兔, 处死后取下角膜, 用 4%多聚甲醛固定 24 h,常规病理制片,片厚 4 m,每隔 5 张A:碱烧伤组; B:保存羊膜移植组
7、 ; C:新鲜羊膜移植组.图 1 角膜碱烧伤后第 14 天和第 60 天碱烧伤组和羊膜移植组的角膜(HE 染色400)Fig 1Corneal appearance of alkali burn group and amniotic membrane transplantation in the 14th and 30th days after alkali burn(HE stain400)取 1 张,HE 染色,光镜观察。1.2.5 多形核中性白细胞(PMN)计数每只角膜取 3 张切片显微镜观察, 从周边到中央随机选取 10 个低倍视野 (100),彩色图像分析仪5读取图像,图像分析软件行
8、 PMN 计数,取均值。1.2.6 微血管数观察每只角膜选 3 张 HE 切片,每张切片任选 10个高倍视野(400),应用图像分析软件计算每个视野下新生血管横断面数目,以管腔完整为准, 管径粗细不计。1.2.7tPA 和总 PAI1 活性测定将解冻的角膜剪碎,每克湿重组织加入预先冷冻的组织液 2 mL,含 1%Triton X100 的 0.1 mol/L TrisHCl 缓冲液 ,匀浆。 4 ,800 r/min 离心 20 min,2 次,取上清液,冻于-70 待测。tPA 和总 PAI1 活性采用发色底物法测定。酶标仪于波长 405 nm 测定光密度,标准曲线分析,测定标本 tPA 及
9、PAI1 的活性。1.3 统计学处理数据以 xs 表示,采用 SPSS 11.5 进行单因素方差分析, 两两比较采用 LSDt 检验方法,用于比较各组在同一时间上的差别,=0.05 为检验水准。2 结果2.1 病理组织学碱烧伤后 14 d,A 组角膜上皮层薄,排列紊乱,且部分缺失,基质水肿 ,板层纤维断裂溶解 ,基质全层特别是坏死区、近溃疡区及邻近溃疡的上皮细胞下可见大量炎症细胞浸润,基质大量新生血管。pAMT 组已形成单层上皮,但形状欠规则,排列不整齐,上皮下6少量炎症细胞浸润,基质中有新生血管。fAMT 组上皮细胞排列较整齐, 上皮下炎症细胞浸润较少, 基质中新生血管较少。碱烧伤后 30
10、d,A 组上皮细胞增生、排列紊乱, 仍有较多的炎症细胞浸润和基质新生血管。pAMT 组上皮排列欠规则,可见少许炎症细胞浸润和基质新生血管。fAMT 组上皮排列较规则 ,炎症细胞浸润及基质新生血管较少。烧伤后 60 d,fAMT 和 pAMT 组角膜上皮生长良好,炎症细胞浸润和新生血管均较 A 组明显减轻(图 1)。2.2PMN 碱烧伤后 14,30,60 d A 组与 AMT 组角膜 PMN 数见表1。2.3 微血管数碱烧伤后 14,30,60 d,A 组与 fAMT 和 pAMT 组角膜微血管数见表 2。 表 1 兔角膜组织中 PMN 数密度表 2 兔角膜组织新生血管数 A:碱烧伤组 ;fA
11、MT:新鲜羊膜移植组 ; pAMT:保存羊膜移植组.与 A 组比较,:P0.01; 与 fAMT 组比较,#:P0.05,#:P0.01.2.4tPA 活性碱烧伤后 14,30,60 d,A 组与 fAMT 和 pAMT 组tPA 活性测定结果见表 3。表 3 碱烧伤后 14,30,60 d 兔角膜组织浸液中 tPA 活性 C:对照组; A:碱烧伤组; fAMT:新鲜羊膜移植组; pAMT:保存羊膜移植组.与 C 组比较,:P0.01; 与 A 组比较,#:P0.01; 与 fAMT 组比较,:P0.05.72.5 总 PAI1 活性总 PAI1 活性是游离型和结合型 PAI1 总的活性, 碱
12、烧伤后 14,30,60 d,A 组与 AMT 组总 PAI1 活性测定结果见表 4。表 4 碱烧伤后 14,30,60 d 兔角膜组织浸液中总 PAl1 活性 C:对照组; A:碱烧伤组; fAMT:新鲜羊膜移植组; pAMT:保存羊膜移植组.与 C 组比较,:P0.01; 与 A 组比较,#： P0.05,#:P0.01; 与 fAMT 组比较,:P0.01.2.6tPA/PAI1 比值术后 l4 d,fAMT 组 tPA 活性低于 pAMT组, 而总 PAI1 的活性高于 pAMT 组。术后 l4,30 d,fAMT 组tPAPAI1 低于 pAMT 组;30,60 d,fAMT 组 t
13、PAPAI1 与C 组相近 (表 5)。3 讨论3.1 羊膜移植促进上皮愈合的可能机制角膜碱烧伤后 ,上皮下的基底膜被破坏,移植羊膜片为角膜上皮的迁徙提供了底物。有研究证实羊膜本身能够产生刺激上皮化的各种细胞因子,如碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等3;羊膜能抑制蛋白裂解酶,减轻炎症反应; 羊膜上皮细胞和基质层可表达抗炎蛋白和抗新生血管蛋白。本研究病理组织学观察,AMT 组角膜上皮修复快, 且上皮排列表 5 碱烧伤后 14,30,60 d 兔角膜组织浸液中 tPA/PAI1 的比值 C:对照组; A:8碱烧伤组; fAMT:新鲜羊膜移植组; pAMT:保存羊膜移植组 . C 组比较,:P
14、0.01; 与 A 组比较 ,#:P0.05,#:P0.01; 与 fAMT 组比较,:P0.05,:P0.05.较规则; 角膜 PMN 计数和微血管数明显低于碱烧伤组,其中fAMT 组又明显低于 pAMT 组,提示羊膜移植治疗碱烧伤具有促进上皮修复、减轻炎症和抑制新生血管生成的作用,而 fAMT 组减轻炎症和抑制新生血管作用较 pAMT 组明显,其原因可能是保存羊膜丧失了部分生物学活性。3.2 角膜碱烧伤后 tPA/PAI1 级联系统的变化 tPA/PAI1 级联系统是蛋白溶解系统的重要组成部分。tPA 是一种丝氨酸蛋白水解酶, 主要以纤溶酶原为作用底物, 将其转化为具有酶活性的纤溶酶而发挥
15、瀑布式级联蛋白水解作用4,降解细胞外基质,参与炎症反应。PAI1 通过与 tPA 不可逆地结合,介导 tPA 降解,从而抑制 tPA对纤溶酶原的激活而发挥其重要的生物学作用5。纤溶系统的活性主要取决于 tPA 及其抑制物 PAI1 的平衡。本研究中碱烧伤后tPA 活性及 tPA/PAI1 明显升高,提示角膜碱烧伤后在各种因子的作用下,产生大量的 tPA,PAI1 作为 tPA 的抑制剂也随之反应性增高,但是 PAI1 增高水平不及 tPA,二者间平衡被打破,tPA/PAI1 比值增高。 tPA 释放入基质,激活纤溶酶原为纤溶酶,从而激活更多的蛋白分解连锁反应,导致角膜胶原纤维降解、基质水9肿、
16、新生血管生成。实验结果证实纤溶系统参与角膜炎症过程,是角膜溃疡形成的重要因素。3.3 羊膜移植对 tPA/PAI1 级联系统的影响羊膜移植后 fAMT和 pAMT 组 tPA 活性、tPA/PAI1 均显著下降,提示羊膜移植,尤其是新鲜羊膜移植,可能通过激活机体自身调控机制,促使 tPA 的活性下调,而 PAI1 的活性相应增强,以维持 tPA 与 PAI1 的精细平衡, 减弱纤维蛋白酶原的激活, 进而抑制下游一系列蛋白水解级联反应的启动,在角膜损伤愈合过程中发挥积极作用。【参考文献】1全国眼外伤职业病学组. 眼部烧伤分度标准J. 眼外伤职业眼病杂志, 1983,5(2):封 3.2李雪, 徐锦堂. 角膜
