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1、1罗格列酮对 RIN-m 细胞高糖损害干预作用研究【摘要】 研究罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对胰岛 细胞高糖损害的干预作用。方法 采用生理浓度葡萄糖（5.5 mmol/L） 、生理浓度葡萄糖+罗格列酮、高浓度葡萄糖（33.3 mmol/L） 、高浓度葡萄糖+罗格列酮培养 RIN-m 细胞。以放射免疫法检测胰岛素分泌水平。以流式细胞仪及 TUNEL 法检测 RIN-m 细胞凋亡。 RT-PCR 方法检测胰腺十二指肠同源盒-1（pancreatic duodenal homeobox factor-1，PDX-1 ）和胰岛素 mRNA 表达。结果 RIN-m 细胞与33.3 mm
2、ol/L 的葡萄糖孵育 2 周后胰岛素分泌功能开始下降，细胞凋亡率增长 2.7 倍（P0.01） 。而罗格列酮可以修复胰岛素的分泌，降低 RIN-m 细胞凋亡率。罗格列酮上调 PDX-1（1.300.06 vs. 1.610.10，P 0.01）和胰岛素 (1.750.09 vs. 1.980.11，P 0.01) mRNA 表达。结论 高糖抑制胰岛 细胞胰岛素分泌，并诱导其凋亡。罗格列酮具有直接保护 细胞免于高糖毒性的作用。 【关键词】 罗格列酮 RIN-m 细胞 凋亡 胰腺十二指肠同源盒-1 Abstract: Objective To investigate the effect of
3、rosiglitazone (R) on high glucose-induced RIN-m cell impairment. Methods The RIN-m cells were cultured in media containing normal glucose (5.5 mmol/L, NG), NG+R 50 mol/L (NG+R), high glucose (33.3 mmol/L, HG) and HG+R 250 mol/L (HG+R). Insulin secretion was measured by radioimmunoassay. Apoptosis of
4、 RIN-m cells were determined by in situ TUNEL method combined with flow cytometry. The mRNA expression of pancreatic duodenal homeobox factor-1 (PDX-1) and insulin was measured by semi-quantitative RT-PCR assay. Results (1) After 2 weeks of incubation, the presence of high glucose increased the apop
5、tosis of RIN-m cells to 2.7 folds and decreased the insulin secretion (P0.05) . The addition of R inhibited the high glucose-induced increase of apoptosis of RIN-m cells and improved the insulin secretion (P0.05). (2) Incubation of RIN-m cells with high glucose plus R for 2 weeks, increased the mRNA
6、 expression of PDX-1 from（1.300.06 ） to (1.630.10)，P0.05 and that of insulin from (1.750.09) to ( 1.980.11), P0.05. Conclusions High glucose can induce cell apoptosis and decrease insulin secretion. R (rosiglitazone) has direct protective effects on cells against the glucotoxicity. Key words: rosigl
7、itazone; RIN-m cell; apoptosis; pancreatic duodenal homeobox factor-1（PDX-1） 持续高糖环境导致胰岛功能缺陷和胰岛数量的减少1 ，最终胰岛 细胞功能衰竭。如何在降糖的同时延缓胰岛 细胞功能减退，3已成为临床上影响糖尿病病程进展的关键，也是影响病程进展和预后的主要因素。目前以 细胞作为干预靶点来治疗糖尿病的药物很少。然而近来多项动物实验及多中心临床研究2-3显示噻唑烷二酮类药物可以延缓胰岛 细胞功能衰竭，但这种作用是源于改善了代谢紊乱还是对 细胞有直接保护作用，并不完全清楚。本研究以体外培养的 细胞系 RIN-m 细胞为对
8、象，研究噻唑烷二酮类药物罗格列酮对胰岛 细胞高糖损害的早期干预作用。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 细胞 RIN-m 细胞购自北京百星高科技术货物进出口公司（来源于 ATCC） ，系射线诱导的大鼠胰岛细胞瘤。 1.1.2 试剂 罗格列酮纯品粉末由四川太极集团提供。无糖型RPMI 1640 购自 Hyclone 公司。胎牛血清购自加拿大 PAA 公司。大鼠胰岛素放免测定试剂盒购自北京科美东雅公司。RT-PCR 试剂盒和 TUNEL 细胞原位凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司。Annix-检测试剂盒购自 Biovision 公司。PCR 引物由上海生工合成。 1.1.3 仪器 MJ P
9、TC-200 PCR 仪（MJ Research Inc，USA） ，凝胶成像系统（上海复日科技公司） ，LEICA Qwin 图像分析和处理系统（德国） ，流式细胞仪(美国 BD 公司 FACSCalibur)。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养与分组 RIN-m 细胞在无糖型 RPMI 1640 中常4规培养，以约 5107/L 接种培养皿中，每 2 天换液 1 次，体外培养。实验分 4 组，每组重复 5 次：生理浓度葡萄糖（ NG）组，培养液含 5.5 mmol/L 葡萄糖；NG+ 罗格列酮（NG+R ）组，培养液含 5.5 mmol/L 葡萄糖+50 mol/L 罗格列酮；高浓度葡萄
10、糖(HG)组，培养液含 33.3 mmol/L 葡萄糖；HG+罗格列酮（HG+R）组，培养液含 33.3 mmol/L 葡萄糖+50 mol/L 罗格列酮。 1.2.2 胰岛分泌功能检测 收集不同时间点（表 1）106 细胞培养液-20 保存。实验结束时采用竞争放射免疫的方法检测胰岛素（INS）水平。 RT-PCR 半定量测定 RIN-m 细胞胰岛素和胰腺十二指肠同源盒-1（pancreatic duodenal homeobox factor-1，PDX-1）mRNA 水平。胰岛素（187 bp,大鼠）：上游引物 5-TGCCCA GGCTTTT GTCAAA CAGCA CCT T-3,
11、下游引物 5-CTCCAGTGCCAA GGTC TGA-3。-actin（542 bp）:上游引物5-CTCTTTGATGTCACGCACGA TTC-3，下游引物 5-ATC GTGGG CCGCTC TAGG C ACC-3，扩增片段长度为 542 bp。胰岛素和 -actin 反应条件： 95预变性 5 min，94 变性 1 min，55退火 40 s，72延伸 40 s，32 个循环，72终末延伸7 min。PDX-1（364 bp，大鼠）：上游引物 5-ACATC TCCCCA TAC GAAGTGCC-3，下游引物 5-AAGTGAGCATCACTGCC AG CTCC-3。P
12、DX-1 反应条件：95预变性 5 min，94变性 60 s，60退火 45 s，72延伸 60 s。共 30 个循环，72 终末延伸510 min。取各组不同时间点的 RNA 2 l 加入 oligdT(12-18)及AMV 逆转录酶进行反转录成 cDNA,然后进行 PCR 反应。PCR 产物行 2%琼脂糖凝胶电泳观察， Smartview 2001 图像分析处理系统采集图象，扫描制片，结果使用 Quantity One 分析软件分析条带的吸光面积，以目的基因与 -actin 吸光面积积分比值计算。 1.2.3 细胞凋亡检测 1.2.3.1 形态学观察 倒置显微镜下观察 RIN-m 细胞在
13、培养过程中形态变化。 1.2.3.2 流式细胞仪分析凋亡 采用 Annexin-检测试剂盒分析早期凋亡率。 1.2.3.3 TUNEL 法检测凋亡率 将生长于 24 孔板中不同条件下培养的大鼠 RIN-m 细胞用 4%的新鲜配置的多聚甲醛固定后,应用TUNEL 细胞原位凋亡检测（生物素标记）试剂盒检测细胞凋亡情况。操作按试剂盒说明，DAB 显色凋亡阳性细胞后,再用苏木素复染阴性细胞核。每份样品随机选取高倍镜视野,分析计数 100 个细胞,计算细胞凋亡百分率。 1.3 统计学处理 整个实验采用完全随机分组、随机对照研究方法。数据以s 表示，用 SPSS 统计软件处理。组间比较采用单因素方差分析，
14、再行 scheffe 法两两比较。P0.01 认为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 胰岛分泌功能检测 62.1.1 胰岛素水平检测 见表 1。HG 组和 HG+R 组胰岛素释放水平先升高后逐渐下降， HG+R 组下降幅度较 HG 组小(P0.01)，而 NG 组和 NG+R 组缓慢下降，无统计学差异(P0.05)。各时间点 HG+R 组胰岛素分泌水平显著高于 HG 组（P 0.01）, 而 NG+R组与 NG 组无显著变化(P0.01) 。 表 1 罗格列酮对高糖诱导胰岛素释放影响 与 NG 组比较：*P0.01；与 NG+R 组比较：#P0.01；与 HG 组比较：P0.01 2.1.
15、2 罗格列酮对 PDX-1 和胰岛素 mRNA 影响 见表 2，图1、2 。PDX-1 和胰岛素 mRNA 二者不同时间点各组变化趋势一致。随时间的延长，NG 组和 NG+R 组 PDX-1 和胰岛素 mRNA 无显著变化。HG 组和 HG+R 组 PDX-1 和胰岛素 mRNA 表达先增强，后下降。HG 组下降幅度大，HG+R 组下降幅度小，两者有统计学差异（P0.01） 。表 2 罗格列酮对高糖诱导的 RIN-m 细胞 PDX-1 和胰岛素 mRNA 表达的影响 第 1 周，HG+R 组与 HG 组 PDX-1 和胰岛素 mRNA 表达无明显差异，但显著高于 NG 和 NG+R 组（P 0
16、.01） 。 第 2 周，HG 组 PDX-1 和胰岛素 mRNA 表达明显下降。HG+R 组显著高于 HG 组（P0.01） 。 2.2 RIN-m 细胞凋亡变化 2.2.1 形态学观察 正常 RIN-m 细胞呈多边不规则形，细胞之间有连接融合倾向，胞质内含有分泌颗粒。培养过程中，各组形态大体无变化。但 HG 组细胞较 NG 组传代后贴壁能力下降，生长缓慢，并时有细胞漂浮脱壁（图 3） 。HG+R 组较 HG 组状态有改善。 72.2.2 流式细胞仪检测凋亡（annexin- 法） NG 组、NG+R组、HG 组、HG+R 组早期凋亡率分别为(6.31.8)% 、(7.612.7)% 、(17.23.5)%、(10.23.6)%，多组比较有显著差异（ P0.01） 。两两比较，HG
