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1、细胞的复苏细胞复苏的原则快速融化：必须将冻存在-196液氮中的细胞快速融化至 37，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。一. 实验前准备： 1.将水浴锅预热至 372.用 75酒精擦拭紫外线照射 30min 的超净工作台台面。3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。二取出冻存管： 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 三迅速解冻： 1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。2.约 1-2min 后冻存管内液
2、体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。四.平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中 3000r/min 离心 3min 五.制备细胞悬液： 1.吸弃上清液。2.向离心管内加入 10ml 培养液，吹打制成细胞悬液。六.细胞计数： 细胞浓度以 5105/ml 为宜。七.培养细胞：将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入 375CO 2 的培养箱内 2-4 小时（或者 24-48 小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。初学者易犯错误： 1 水浴锅未预热或者未预热到 37。2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。3.离心前忘记平衡，导致
3、离心机损坏和细胞丢失。4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。版本 2一、细胞复苏的原则在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。二、细胞复苏的主要操作步骤（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。（2）迅速放入 38水浴中，并不时摇动，在 1 分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。（3）在 1000r/min 速度下离心 510 分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度 1109/L，置 37温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养 1224 小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。三、注意事项在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-50）。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。
