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1、目 录摘要 .IAbstract .II1 前言 .11.1 蜘蛛毒素的组成.11.1.1 蜘蛛毒素的蛋白质类成分 .11.1.2 蜘蛛毒素的多肽类成分 .21.2 多肽类蜘蛛毒素的研究现状.21.2.1 作用于电压门控钠离子通道毒素 .31.2.2 作用于电压门控钾离子通道毒素 .41.2.3 作用于电压门控钙离子通道毒素 .41.3 已研究的敬钊毒素概况.61.4 JZTX-XI 的研究状况 .81.5 固相合成的优缺点.101.6 固相合成的研究发展前景.112 实验部分 .122.1 固相合成的基本原理.122.1.1 树脂的选择和氨基酸的固定 .122.1.2 氨基、羧基、侧链的保护
2、和去除 .132.1.3 缩合反应与裂解 .132.2 实验试剂与仪器.142.3 实验方法.142.3.1 多肽的仪器合成与裂解 .142.3.2 多肽的分离纯化与质谱鉴定 .152.3.3 合成肽的复性摸索 .152.3.4 JZTX-XI 突变体 M5A-JZTX-XI 的合成、复性和分离纯化 .163 结果与讨论 .173.1 JZTX-XI 的固相合成结果.173.2 JZTX-XI 的氧化复性结果.193.3 M5A-JZTX-XI 的合成和复性结果.203.3.1 合成的 M5A-JZTX-XI 反相 HPLC 和质谱 .203.3.2 复性 .223.4 影响多肽固相化学合成条
3、件的讨论.243.4.1 合成的环境和试剂要求 .243.4.2 氨基酸侧链基团对合成的影响 .253.4.3 固相肽合成仪的影响 .253.4.4 树脂和催化剂的影响 .253.4.5 裂解时间的影响 .263.5 影响合成多肽的氧化复性条件的讨论.26参考文献 .27致 谢 .29化学化工学院 2010 届本科毕业论文I敬钊毒素 -XI（JZTX-XI）及其突变体M5A-JZTX-XI 的固相合成与复性摘要：敬钊毒素-XI(JZTX-XI)是从敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)粗毒中分离纯化到的一种新型的肽类神经毒素，由34个氨基酸残基组成，其中6个半胱氨酸形成3对二
4、硫键，其一级结构为：ECRKMFGGCSVDSDCCAHLGCKPTLKYCAWDGTF。为了研究JZTX-XI结构与功能的关系，用芴甲氧羰基 (Fomc)固相多肽合成方法仪器合成了天然JZTX-XI和突变体M5A-JZTX-XI，并通过反相HPLC和质谱对不同条件下的氧化复性结果进行监测，从而得到合成多肽的最佳氧化复性条件为：pH 为8的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液、1.0 mmol/L 的GSH、0.1 mmol/L 的GSSG，样品质量浓度为0.01 g/L，温度为4,时间为 24 h。复性产物经质谱测定其相分子质量与理论分子质量相符。关键词：JZTX-XI；固相多肽合成；
5、突变体； 反相HPLC；氧化复性化学化工学院 2010 届本科毕业论文IISynthesis and Folding of M5A-JZTX-XI：a Mutant of Jingzhaotoxin-XIAbstract： Jingzhaotoxin-XI (JZTX-XI) is a novel peptide neurotoxin isolated from the venom of the spider Chilobrachys jingzhao. It is composed of 34 residues with three disulfide bonds. The primary
6、structure of JZTX-XI is ECRKMFGGCSVDSDCCAHLGCKPT LKYCAWDGTF.In order to investigate the structure-function relationship of JZTX-XI, the natural JZTX-XI and mutant M5A-JZTX-XI were synthesized by solid-phase chemistry method with Fmoc-protected amino acids on the PS3 automated peptide synthesizer. Re
7、verse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and matrix assisted laser desorptionion ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS) were used to monitor the oxidative refolding of synthetic linear peptides to find the optimal renaturation conditions of toxins. When sa
8、mples (0.01 g/L) were dissolved in 0.1 mol/L Tris-HCl buffer containing 1.0 mmol/L reduced glutathion (GSH) and 0.1 mmol/L oxidized glutathion (GSSG) at pH 8.0 and, 4，the best time is 24 h. the best renaturation yields of synthetic peptides were obtained. The experiments also proved that the relativ
9、e molecular masses of renatured peptides were in accordance with their theoretical molecular masses.Key words： JZTX-XI; solid-phase synthesis; mutant; MALDI-TOF; oxidative folding化学化工学院 2010 届本科毕业论文11 前言 多肽是涉及生物体内各种细胞实现生理功能的重要物质，对于多肽的研究，当今世界已经出现了一个空前的繁荣景象。多肽的合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽合成，可以解决科研过
10、程中许多棘手的问题：多肽合成可以验证一个新的多肽的结构；用于研究结构与功能的关系；设计新的多肽；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；改造多肽分子；合成新的多肽药物等。 多肽的化学合成技术的发展近些年来迅猛发展。而近几十年来，固相法合成多肽以它省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽类合成的最常用的方法。1.1 蜘蛛毒素的组成人们一般把蜘蛛毒素分子分为三大类：第一类是分子量 1 kDa 以下的小分子物质。第二类也是含量最丰富的一类，为分子量 1 到 10 kDa 之间的多肽类毒素。第三类是分子量 10 kDa 以上的蛋白质类。毒素中的小分子物质有很多种，以前的研究探明，蜘蛛毒素中的小分子物质主要有无机盐类（Na +、K +、Ca 2+、Cl -） 、氨基酸、核苷酸、有机碱、多胺类物质和神经递质（如多巴、GABA、肾上腺素）等 1。目前，很多小分子物质的作用和意义还不清楚，有人认为小分子物质可能会加强毒素对猎物的伤害，还有人认为只是一些降解产物。在对小分子物质的研究中，对多胺类物质的研究已经呈现一
