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1、1细胞骨架相关基因在大鼠肝再生中表达模式分析作者：李红蕾 陈晓光 张富春 马纪 徐存拴 【摘要 】 目的：在基因转录水平了解细胞骨架相关基因在大鼠肝再生中的作用. 方法： 采用搜集网站资料和查阅相关论文等方法获得上述基因，用 Rat Genome 230 2.0 芯片检测它们在大鼠再生肝中的表达情况，用真、假手术比较方法确定肝再生相关基因. 结果：初步证实 249 个参与细胞骨架结构和功能的基因与肝再生相关. 其中，肝再生启动部分肝切除（PH）后 0.54 h 、G0/G1 过渡（PH 后 46 h） 、细胞增殖（PH 后 666 h） 、细胞分化和组织结构功能重建（PH 后 72168 h）
2、等 4 个阶段起始表达的基因数为107, 29, 137 和 5，基因总表达的次数为 209, 113, 1063 和 326. 表明相关基因主要在肝再生启动阶段起始表达，在不同阶段发挥作用. 它们表达的相似性分为均上调、上调占优势、均下调、下调占优势、上调和下调相近等 5 类，涉及 107, 37, 67, 28 和 10 个基因，它们共上调 1118 次，下调 480 次，分为 40 种表达模式. 表明肝再生中细胞生理生化活动具有阶段性、多样性和复杂性. 结论： 肝再生早期和前期微丝形成相关基因表达增强，早期、前期和后期微管形成相关基因表达增强，早期、中期和后期中间纤维形成相关基因表达增强
3、，前期核纤层形成相关基因表达增强. 【关键词】 部分肝切除；大鼠；Genome 230 2.0 芯片；细胞骨2架；基因；肝再生 0 引言 肝脏有重要功能和再生能力. 部分肝切除（partial hepatectomy, PH）后，残肝细胞迅速进入细胞周期循环以补偿丢失的肝组织，该过程称为肝再生（liver regeneration, LR） 1. 通常，根据细胞的生理活动将肝再生分为启动（PH 后 0.54 h） 、G0/G1 过渡（PH 后 46 h） 、细胞增殖（ PH 后 666 h） 、细胞分化和组织结构功能重建（PH 后 72168 h）等 4 个阶段. 根据时间进程分为早期（PH
4、后 0.54 h） 、前期（ PH 后 612 h） 、中期（PH 后 1666 h）和后期（PH 后 72168 h）等 4 个时期，涉及细胞激活、去分化、增殖及调控、再分化、组织结构和功能重建等生理生化过程. 研究表明，细胞骨架在维持细胞形态、运动、基因表达、信息传递以及能量转换等方面具有重要作用. 通常根据纤维粗细和结构将细胞骨架分为微丝(56 nm)、微管(2025 nm)、中间纤维(711 nm)和核纤层. 微丝又称肌动蛋白纤维，由球形亚基装配成的 螺旋纤维组成. 肌细胞中肌动蛋白成束排列构成肌原纤维, 具有收缩功能2. 在非肌细胞中微丝是一种动态结构,以不同的结构形式来适应细胞活动
5、的需要. 微管是 和 微管蛋白亚基二聚体组装成的中空管状结构,呈网状和束状分布,并能与其他蛋白共同组装成纺锤体、基粒、中心粒、纤毛、鞭毛、轴突、神经管等结构，在维持细胞形态、运输、染色体运动等活动中起重要作用3. 中3间纤维是 螺旋杆状蛋白装配成的坚韧纤维，在维持细胞形态、微管装配和稳定中起重要作用，亦与细胞分化密切相关. 在结构上核纤层与中间纤维有密切联系，核纤层与细胞核形态、结构和功能维持密切相关. 为在基因转录水平了解参与大鼠细胞骨架结构和功能的基因在肝再生中的作用，我们用含 485 个细胞骨架相关基因的Rat Genome 230 2.0 芯片检测了大鼠 2/3 肝切除后基因表达情况，
6、发现其中 249 个基因与肝再生相关4 ，在此基础上，进一步分析了它们在肝再生中表达动态、模式和作用. 1 材料和方法 1.1 材料实验用 SD 纯系大鼠由河南师范大学实验动物中心提供，体质量 200250 g. 将 264 只大鼠随机分组，每组 6 只. 其中，22组施行部分肝切除，22 组行假手术. 部分肝切除组用外科手术方法切除大鼠左叶肝和中叶肝，并于 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 96, 120, 144 和 168 h 的相应恢复时间颈椎脱臼处死动物，接着切取右叶肝置 4 PBS
7、 中涮洗 3 次，然后从其中部取肝组织 100200 mg，将同组的 6 只大鼠肝样混合总肝量为(0.10.2 g)6=0.61.2 g ，于 -80 保存备用. 对照组材料为成年大鼠肝，取材方法同部分肝切除组. 假手术组除不切除肝叶外，其他同部分肝切除组. 实验中严格遵循中国动物保护法. 1.2 方法 1.2.1 总 RNA 提取与纯化总 RNA 提取按 Invitrogen 公司的Trizol 试剂盒操作指南进行. 总 RNA 纯化按 Qiagen 公司的4RNeasy Mini 试剂盒操作指南进行 . 在 260/280 nm 波长下测定总RNA 浓度和纯度. 用琼脂糖凝胶电泳（180
8、V, 0.5 h）检测总 RNA质量，实验用样品总 RNA 的 28 S 和 18 S 亮度比例约为 21. 1.2.2cDNA, cDNA 的合成与纯化以 T7(dT)24 Primer 作引物，取 5 g 总 RNA 作模板，通过 SuperScript II RT 反转录系统合成cDNA 第 1 条链，按 Affymetrix cDNA 单链合成试剂盒操作指南合成 cDNA 第 2 条链. 按 cDNA 纯化指南纯化 cDNA. 用上述纯化的cDNA 12 L 作为模板，按 GeneChip IVT 标记试剂盒操作指南合成生物素标记的 cRNA，最后按 cRNA 纯化指南纯化 cRNA.
9、 两者的浓度、纯度和质量检测方法同上. 1.2.3cDNA 片断化与芯片检测在 1 g/L 的 cRNA 溶液 15 L 中加入 5片断化缓冲液 6 L 和无 RNA 酶水 9 L 混匀，94 温浴35 min，得到长度为 35200 bp 的 cRNA 片断. 按 Affymetrix 公司提供的配方配制杂交液，将经过预杂交处理的 Rat Genome 230 2.0 芯片放入杂交液中，于 45 ，60 r/min 条件下杂交 16 h，然后吸去杂交液，在 GeneChip 全自动洗涤工作站 450(Affymetrix公司，USA)中洗涤和染色芯片 . 用高分辨芯片扫描仪3000(Affy
10、metrix 公司， USA)扫描芯片获得扫描图像4. 1.2.4 芯片检测结果分析用 Affymetrix GCOS 1.4 软件将上述扫描图像转化为信号值. 根据探针信号值的 P值确定基因表达（P0.05） 、临界表达（ 0.050.065）. 然后分别对每张芯片的信号值做均一化处理，用实验组的均一化与对照组的均一化比值得出5某一基因是否发生表达变化，当比值2 倍时，视为基因表达上调，当比值0.5 倍时，视为基因表达下调 4. 为减少芯片分析误差，每个时点的再生肝均用 Rat Genome 230 2.0 芯片重复检测 3 次，将 3 次检测的平均值视为矫正值使用 . 最后用 GeneMa
11、th, GeneSpring 和 Microsoft Excel 等分析软件对各组数据进行统计和聚类分析4. 1.2.5 肝再生相关基因的确认 根据 Geneontology (www.geneontology.org)网站的生物活动分类，将微丝、微管、中间纤维和核纤层分别输入 Ncbi (www.ncbi.nlm.nih.gov）和Rgd(rgd.mcw.edu）等网站查找大鼠、小鼠和人的相关基因，并根据 Genmapp (www.genmapp.org） 、Kegg (www.genome.jp/kegg/pathway.html#amino）和Biocarta( 然后查阅相关文献资料对上
12、述基因进行再确认. 除大鼠基因外，将现在认为只存在于人和/或小鼠、在大鼠肝再生发生中有意义、表达变化的基因视为大鼠同源基因. 最后把三次检验结果相同或相似、至少在部分肝切除后一个时点表达上调或下调两倍以上、部分肝切除组与假手术组差异显著（0.01P0.05 ）或极显著（P0.01）的大鼠基因和大鼠同源基因视为肝再生相关基因. 2 结果 2.1 细胞骨架相关基因在肝再生中的表达查 Ncbi, Genmapp, Kegg, Biocarta 和 Rgd 等网站表明，参与细胞骨架的基因数为 8406个；查 Rat Genome 230 2.0 芯片资料表明，该芯片含上述的 485个基因. 其中 24
13、9 个基因至少在 PH 后一个时点发生了有意义表达变化，并且部分肝切除组与假手术组有显著或极显著差异,3 次 Rat Genome 230 2.0 芯片检测结果具有可重复性. 因此，初步确认这些基因与肝再生 (liver regeneration, LR) 相关. 其中，参与细胞骨架的 107 个基因在肝再生中表达上调，67 个基因表达下调，75 个基因在有的时点表达上调，有的时点表达下调（简称上/下调表达）. 它们的上调范围为对照的 2180 倍，下调范围为对照的 220 倍. 肝再生中基因起始表达的总体情况是：144 个基因起始上调，105个基因起始下调. 其中，在启动阶段（PH 后 0.
14、54 h）60 个基因起始上调，27 个基因起始下调；G0/G1 过渡阶段（ PH 后 46 h）18 个基因起始上调，11 个基因起始下调；细胞增殖阶段（PH 后666 h）82 个基因起始上调，55 个基因起始下调；细胞分化和组织结构功能重建阶段（PH 后 72168 h）2 个基因起始上调，3 个基因起始下调. 肝再生中基因表达的总体情况是：共表达上调 1118次，下调 480 次. 其中，肝再生启动阶段（PH 后 0.54 h）基因上调 149 次、下调 60 次；G0/G1 过渡阶段（PH 后 46 h）基因上调 91 次、下调 22 次；细胞增殖阶段（PH 后 666 h）基因上调
15、758 次、下调 305 次；细胞分化和组织结构功能重建阶段（PH 后72168 h）基因上调 211 次、下调 115 次（图 1）.基因表达贯穿于整个肝再生. 其中，在 0.5,2,636,42 和 60 h 起始表达上调基因占优势，在 1 和 48 h 起始表达下调基因占优势，其他时点只7有极少数基因起始表达. 2.2 细胞骨架相关基因在肝再生中表达的相似性和时间相关性根据肝再生中基因表达相似性将上述 249 个基因分为均上调，上调占优势，均下调，下调占优势，上调和下调相近 5 类，涉及 107, 37, 67, 28 和 10 个基因（图 2 上方树）. 根据肝再生中基因表达的时间相关
16、性将上述基因分为 0.5 h, 1 和 120 h, 212 h, 16 h,18 和 48 h, 24 和 36 h, 30 和 42 h, 54 和 60 h, 66 和 72 h, 96 h, 144 和 168 h 等 13 组，表达上调和下调的基因数分别为 29 和 8；87 和59；38 和 11；91 和 22；82 和 21；55 和 18；143 和 74；135和 76；82 和 36；140 和 50；127 和 40；42 和 24；67 和41（图 2 右侧树） . 上调表达基因主要为促进细胞骨架形成基因. 下调表达基因主要为抑制细胞骨架形成基因. 非点状柱示起始表达基因；点状柱示总表达基因；灰底柱示表达上调基因；白底柱示表达下调基
