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1、1紫杉醇耐药的卵巢癌细胞中 PKC【关键词】 卵巢癌,紫杉醇耐药,PExpressions of PKC and Pgp in Taxolresistant ovarian cancer cell line A2780/Taxol【Abstract】 AIM: To detect the expressions of Pglycoprotein （Pgp）and protein kinase C(PKC ) isoform in Taxolresistant ovarian cancer cell line A2780/Taxol. METHODS: Immunohistochemical S
2、P method and doublelabeled immunofluorescence were used to determine the expressions of Pgp and PKC in A2780/Taxol and A2780.Western Blot was employed for assess Pgp expression after A2780/Taxol was cocultured with phorbol myristate acetate(PMA) or staurosporine (SP). RESULTS: There was a coexpressi
3、on of Pgp and PKC in A2780/Taxol, but Pgp was not expressed in A2780.And the expression level of Pgp in A2780/Taxol was not affected by the presence of PMA and SP. CONCLUSION: Pgp and PKC play important roles in the resistance of ovarian cancer cell A2780 to taxol.2【Keywords】 ovarian neoplasms; Taxo
4、l resistance, Pglycoprotein; protein kinase C【摘要】目的： 探讨 PKC与 Pgp 在紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞系 A2780/Taxol 中的表达. 方法： 免疫细胞化学 SP 法及免疫荧光双标检测 PKC与 Pgp 在耐药细胞 A2780/Taxol 及其亲本细胞中的表达； Western Blot 检测并半定量分析 PKC 激动剂佛波脂(PMA)和抑制剂十字孢碱(SP)作用后 Pgp 在两种细胞上的表达水平. 结果： 免疫细胞化学结果表明在 A2780/Taxol 中，Pgp 与PKC 表达均呈阳性，而在亲本细胞中，Pgp 不表达，PKC 呈
5、阳性表达. 在 A2780/Taxol 中 PKC与 Pgp 有共表达 . SP 及 PMA 作用后，A2780/Taxol 细胞 Pgp 表达无明显差别. 结论： 卵巢癌对紫杉醇耐药的产生与 PKC和 Pgp 有关.【关键词】 卵巢癌，紫杉醇耐药，P 糖蛋白，蛋白激酶 C0 引言紫杉醇在卵巢癌化疗中占有重要地位，而耐药是影响疗效的重要因素. 多药耐药基因(mdr1)编码的 P 糖蛋白(Pglycoprotein, Pgp)的过表达是紫杉醇耐药机制之一，而 Pgp 是由蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)磷酸化而发挥功能的，在 PKC 众多同功3酶中又以 同功酶(PKC)与
6、多药耐药(multi drug resistence, MDR)关系最为密切 . 因此我们培养紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞，研究其 Pgp 及 PKC的表达，为逆转耐药提供依据.1 材料和方法1.1 材料卵巢癌细胞系 A2780 及其紫杉醇耐药孕系(A2780/Taxol)由王泽华教授惠赠，培养于含有 100 mL/L 小牛血清的 DMEM 完全培养基，置于 37 ， 50 mL/L CO2，相对湿度 90% 的培养箱中培养；试剂 DMEM 购于 Gibco 公司，鼠抗人 MDR1 mAb 及兔抗人 PKC pAb 购于 Boster 公司， SP 免疫组化试剂盒，罗丹明标记的羊抗兔 IgG 及
7、 FITC 标记的羊抗鼠 IgG 购于北京中山金桥生物技术公司，十字孢碱(SP)和佛波脂(PMA)购于 Sigma 公司. 1.2 方法1.2.1 细胞爬片 A2780 和 A2780/Taxol 细胞按 2106 个/L浓度接种于装有防脱处理的盖玻片的 6 孔板中培养 24 h，取出爬片，10 mol/L PBS 冲洗 2 次，950 mL/L 乙醇固定 10 min，中性树胶黏于载玻片上. 1.2.2 免疫组化 SP 染色取上述细胞爬片，封闭后分别滴加鼠4抗人 MDR1 mAb(150)和兔抗人 PKC pAb(1100), DAB 显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片. 1.2.3
8、免疫荧光双染细胞爬片同上，滴加 MDR1 mAb(150)和兔抗人 PKC pAb(1100)，4冰箱孵育过夜，滴加 FITC 标记的羊抗鼠 IgG 和罗丹明标记的羊抗兔 IgG，PBS 振洗，甘油封片. 同时设 PBS 代替一抗的阴性对照.1.2.4Western Blot 实验分组 1 组： A2780 细胞阴性对照组，2 组： A2780/Taxol 细胞组；3 组： A2780/Taxol 细胞+PMA 组：培养 A2780/Taxol 细胞，PMA 浓度 200 nmol/L 与细胞共同孵育40 min 后收集细胞；4 组 A2780/Taxol 细胞+SP 组： 培养A2780/T
9、axol 细胞，SP 浓度 100 nmol/L 与细胞共同孵育 2 h 后收集细胞. 按文献1提取总蛋白，Lowry 法定量，取 20 g蛋白样品进行 SDSPAGE 电泳，分离胶浓度 7.5%，浓缩胶浓度 5%，并电转移至硝酸纤维素膜上，用含 10 mol/L BSA 的 TBST 4冰箱封闭过夜，加入兔抗人 Pgp pAb（1500 ） ，室温轻摇 60 min，加入羊抗兔 APIgG,显色液避光显色 2 min，同时，以 actin作内参. Western Blot 结果以 Image 软件做图像弧度扫描，半定量采用与actin的灰度比计算.统计学处理： 以 SPSS 统计软件对结果进
10、行统计分析，采用5多样本 snkq 检验. 2 结果2.1Pgp 在 A2780/Taxol 细胞中的表达免疫细胞化学 SP 染色结果表明 Pgp 在 A2780/Taxol 细胞中表达为阳性（图 1） ，在A2780 细胞中不表达；PKC 在两种细胞中均表达，在A2780/Taxol 细胞中表达呈强阳性(图 2)；免疫荧光双标结果示Pgp 与 PKC在 A2780/Taxol 细胞中有共表达现象，在 A2780 细胞中仅有红色荧光，即仅有 PKC的表达（图 3）.图 1图 3略2.2SP 和 PMA 作用后 Pgp 在 A2780/Taxol 细胞中的表达A2780/Taxol 组在 Mr
11、为 170103 位置有明显条带. Western Blot半定量结果显示： A2780/Taxol 组，A2780/Taxol+PMA, A2780/Taxol+SP 组 Pgp 与 actin的灰度扫描值分别是28.93%， 29.34%, 28.57%，差异无统计学意义(P0.05)，说明 3,4 组，与 2 组相比 Pgp 表达量并无明显增加或减少（图 4）.图 4略3 讨论6紫杉醇耐药的机制很多，目前比较确定的有 Pgp 表达的升高，微管 亚基的改变，微管 亚基的改变及凋亡途径改变. MDR1 基因编码的 Pgp 是一种跨膜转运蛋白，具有 ATP 酶活性，能将化疗药物从细胞内泵出，降
12、低细胞内的有效药物浓度而致多药耐药2. PKC 是一种普遍存在的磷脂依赖性酶，与细胞增殖，分化，凋亡的信号转导息息相关, 也参与了多 MDR 形成过程的调控3. Gottesman 等4在早期的研究中证明 Pgp 是由 PKC 磷酸化的，磷酸化后的 Pgp 活化而具有跨膜转运功能，并且这种磷酸化过程能够被 verapamil 抑制，而被 PKC 激活剂增强 5 ，PMA 就与 PKC具有高亲和力,可以激活 PKC. 而现已证实 PKC 存在至少 11 种不同亚型，它们都是由不同基因编码的功能相似的同功酶，广泛分布在各器官组织和细胞，它们在结构，生化性质，组织分布，亚细胞定位和底物特异性方面都有
13、差别6. 韩英等7检测了 PKC,在胃癌及其长春新碱耐药株中的表达，结果表明胃癌细胞SGC7901/ VCR 的耐药机制可能与 PKC有关,而与 PKC无明显相关性，相关实验还表明PKC 可能通过调节 Pgp 的功能与表达而参与胃癌细胞多药耐药的形成. 这说明在 PKC 的众多亚型中，尤以 亚型与 Pgp 磷酸化关系最为密切 8.本实验我们采用 Western Bolt 检测 Pgp 的表达，结果显示A2780 细胞表达呈阴性，而 A2780/Taxol 细胞中 Pgp 的表达呈阳7性，表明卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药性产生与 Pgp 过表达有关. 该实验还通过免疫组化检测到在 A2780/Tax
14、ol 细胞中 PKC表达强于其在 A2780 细胞中的表达，这个结果说明 Pgp 通过 PKC活化而发挥功能，与上述理论相符，因此在免疫荧光双标实验中可以很清晰地看到 Pgp 与 PKC的共表达. 本试验我们还使用 PKC 激动剂PMA 和抑制剂 SP 分别作用于 A2780/Taxol 细胞，通过 Western Blot 检测和半定量分析并未发现个组间 Pgp 表达有差别，这说明PKC活性的增强或减弱在短时间作用后并不能使 Pgp 表达量增加. 然而，不同亚型同功酶在卵巢癌对紫杉醇耐药中起什么样的作用，对 Pgp 的表达和功能有什么影响，以及 SP 和 PMA 长时间作用后能否影响 Pgp
15、 的表达量，还有待进一步实验. 这些研究将对卵巢癌患者的化疗具有重要意义. 【参考文献】1 Sambiuok J, Fritsch EF, Maniatis T 分子克隆M 金冬雁，黎盂枫. 译 2 版 北京： 科学出版社1996:889-890.2Aouali N, Eddabra L, Macadr J, et al. Immunosuppressors and reversion of 8multidrugresistanceJ . Crit Rev oncal Heamato, 2005, 56(1):61-70.3Kitazaki T, Oka M, Nakamura Y, et a
16、l. Gefitinib, an EGFR tyrosine kinase inhibitor,directly inhibits the function of Pglycoprotein in multidrug resistant cancer cellsJ. Lung Cancer, 2005,49(3):337-343.4 Gottesman MM, Ling V. The molecular basis of multidrug resistance in cancer: The early years of Pglycoprotein researchJ. FEBS Lett, 2006,580(4):998-1009.5 Minko T, Batrakova EV, Li s, et al. Pluronic
