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1、1紫杉醇对膀胱癌 EJ 细胞株增殖抑制及诱导凋亡的作用作者：郭春龙 黄艳丽 朱晓敏 张春阳 冯禄 王赞滔 姜华茂【关键词】 紫杉摘要：目的：探讨紫杉醇体外抑制膀胱癌 EJ 细胞株及诱导凋亡的作用。方法：体外培养膀胱癌 EJ 细胞株，以不同浓度紫杉醇处理 1272h 后， 通过 MTT 法测定细胞生长抑制作用，采用电镜观察和 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果：紫杉醇能抑制 EJ细胞的生长，并在一定剂量和时间范围内呈现出明显的时间、浓度依赖关系。电镜下凋亡细胞体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成花瓣形。电泳见出现典型的凋亡 DNA 梯形带。结论：紫杉醇能抑制膀胱癌 EJ 细胞株的生长
2、，诱导凋亡可能为其抗肿瘤作用机制之一。关键词：紫杉醇；膀胱癌；细胞凋亡 膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，手术切除是膀胱癌治疗的首选方法。但是膀胱癌的易复发性常使单纯采用手术疗法难以获得满意疗效，应用化疗作为辅助治疗手段可望减少肿瘤患者的复发率，提高其生存率。紫杉醇（Paclitaxel，商品名： Taxol）是从紫2杉树皮中提取的一种新型抗微管广谱抗癌药，具有特异性地稳定细胞微管的作用1 。本研究旨在体外观察紫杉醇对膀胱癌 EJ 细胞株的抑制和诱导凋亡作用，以探讨紫杉醇对膀胱癌的临床应用价值。1 材料与方法11 试剂紫杉醇由上海华联制药有限公司提供，临用前稀释至所需浓度；RPMI1640 培养
3、基 (含 10胎牛血清，青霉素及链霉素各100U/ml)；L 谷氨酰胺 2mmol/L、丙酮酸钠 1mmol/L 购自华美公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自 Sigma 公司。12 细胞培养人膀胱癌 EJ 细胞株购自上海午立生物有限公司，培养于含有10胎牛血清，100 U/ml 青霉素、链霉素的培养基中，在 37 、5 CO2 培养箱内常规传代培养。取对数生长期细胞用于实验。13 实验分组对照组：不加药，每天更换 1640 全培养液。实验组：紫杉3醇浓度分别为 10、50、100、500nmol/L，接种细胞 24h 进入对数生长期后开始加药，每天换液以维持药物浓度恒定。14 细胞毒性分析应用
4、 MTT 比色法测定不同浓度紫杉醇对 EJ 细胞增殖的影响，并绘制剂量效应曲线。将对数生长期的 EJ 细胞以 0.25胰蛋白酶消化，用含 10胎牛血清的 RPMI1640 培养液配成单细胞悬液，细胞数为 2104/ml 接种于 96 孔培养板。接种细胞 24h 进入对数生长期后开始加入不同终浓度的紫杉醇，每浓度设 4 个复孔，并设对照孔。置于 37含 5 CO2 孵箱中分别培养 12、24、48 、72h后每孔加 MTT（5mg/ml）20l。作用 4h 后弃上清，各孔加入100l DMSO，振荡 10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm 波长处读取吸光度 A 值。细胞生长的抑制率（）
5、（对照组 A 值实验组 A 值）/ 对照组 A 值1002 。15 透射电子显微镜观察取对照组及实验组细胞（细胞数量为 106107）倒出瓶中培养液，用 PBS 液（0.01mol/L，pH7.2）洗 3min3 次，后加入2.5戊二醛 4放置 10min。用接种环刮下细胞移入离心管中，2000r/min 离心 15min。用接种环刮起细胞块，将细胞块与戊二醛4一起转移到青霉素小瓶中，4 放置 2h。用 PBS 洗 3min3 次（注意加液时一定不要冲散细胞团块） ，1锇酸在 4 固定 1h。PBS洗 3min3 次，脱水（50、70、80、90、100乙醇各1 次 15min/次；100丙酮
6、 2 次，10min/次） 。吸弃瓶中的脱水剂，加 3ml 纯丙酮 EPON812 包埋剂（1 ：1 体积比） ，室温下放置30min 后，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂 1ml 室温放置 2h 或过夜。吸混合包埋剂 2 滴于 2 号胶囊模块孔的底部，把细胞团块移入胶囊底部中心，注意混合包埋剂，置 37、45 分别 12h，置60 24h，修块，制备半薄切片，定位后制备超薄切片，醋酸铅铀染色，透射电镜观察。16 DNA 提取及电泳分析取对数生长期的 EJ 单细胞悬液 2106 个接种于培养瓶内，24h 后待细胞进入对数生长期开始加入不同浓度的紫杉醇，培养48h 收集贴壁及悬浮细胞， 1000r/
7、min，离心 5min，弃培养液，再加入 1mlPBS 重悬细胞移入 1ml 微量离心管中，1000r/min，离心 5min 弃上清。加入 50l 细胞裂解液，混匀，于 37 水浴至混合物变得清亮。在高速冷冻离心机中4 12000/min，10min，将上清转移至另一微量离心管中。以等体积的苯酚/氯仿（1 ：1） ，苯酚/氯仿/异丙醇（25：24：1 ）和氯仿各抽提一次。在上清中加入 1/10 体积 3mol/L 醋酸钠和 2 倍体积的无水冷乙醇，于 20 沉淀过夜。在4 12000r/min 离心 10min。收集将沉淀溶入520lTBE 缓冲液，加入 1l RNA 酶，37保温 1h。加
8、入 4l 样品缓冲液，混匀，立即加到含有 0.4g/ml 溴化乙锭的 2琼脂糖凝胶的样品中，室温，于 1TBE 缓冲液中 5V/cm 电压下电泳 1h。以标准品 100bp DNA lader 为对照。紫外分析仪观察实验结果并拍照3 。2 结果21 MTT 结果随培养基中紫杉醇浓度的增加和培养时间的延长，EJ 细胞增殖明显受抑制。50500nmol/L 组作用一定时间后均可产生较强的抑制效应。其中 100nmol/L 和 500nmol/L 组分别于 72h、48h 达到 IC50，提示紫杉醇对 EJ 细胞增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性，见图 1。22 电镜结果对照组细胞呈梭形，细胞增殖活跃
9、，内可见多个细胞核，染色质分布均匀。实验组细胞体积缩小，细胞变圆，细胞核染色质发生边集，固缩，在细胞核膜周边聚集形成新月体形或花瓣形，电子密度增强，细胞膜保存完整，在细胞膜表面微绒毛消失，见图 2。623 电泳结果对照组基因组条带由于分子量大，迁移距离短，所以停留在加样孔附近。紫杉醇为 10nmol/L 浓度组，由于紫杉醇浓度较低，未出现典型的 DNA 梯形带。紫杉醇在 50nmol/L 以上浓度组作用后出现典型的 DNA 梯形带，见图 3。3 讨论紫杉醇是从紫杉树皮中提取的一种抗癌新药，它可促进微管双聚体装配成微管，又可防止微管解聚，这种稳定性作用可抑制微管正常的力学重组，影响细胞的正常分裂
10、，同时紫杉醇与微管蛋白结合十分稳定，从而抑制细胞内外某些调控因素对微管系统的作用，可诱导细胞最终以凋亡方式死亡4 。此外，尚可激活宿主的巨噬细胞，通过释放免疫因子调节机体免疫功能。临床应用表明，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌等有效，尤其对耐常规药物的肿瘤也取得了较好疗效。细胞凋亡是一种相对于细胞坏死主动的程序化的细胞死亡形式。许多因素包括化疗药物可引起肿瘤细胞凋亡，因此，细胞凋亡为肿瘤治疗提供了新的思路和靶点。许多化疗药物均能不同程度地7诱导细胞凋亡，肿瘤细胞凋亡敏感性是影响化疗效果的重要因素，如何诱导细胞凋亡已成为新的化疗目标5 。本实验通过 MTT 法观察到紫杉醇能明显抑制 EJ 细胞的生长，而且
11、在一定剂量范围内具有时间和浓度依赖性。紫杉醇浓度为 50nmol/L 时即有明显抑制作用。在 100nmol/L 和 500nmol/L 组分别于 72h 和 48h 达到IC50，但同时我们在倒置显微镜下观察到在 500nmol/L 作用 72h时有少量细胞，细胞膜破裂形成颗粒状无定型碎片，呈坏死改变，说明随着紫杉醇浓度的增大和作用时间的延长，它的细胞毒性也增加。我们认为紫杉醇浓度为 100nmol/L 时为诱导 EJ 细胞凋亡比较理想浓度。电镜下可见在紫杉醇作用后，细胞体积缩小，细胞变圆，细胞核染色质发生边集、固缩，在细胞核膜周边聚集，形成新月形，电子密度增强，细胞膜保存完整，呈现出典型的
12、细胞凋亡改变。电泳见对照组未出现 DNA 梯形带，而紫杉醇为 10nmol/L 浓度组由于凋亡细胞较少也未出现典型的 DNA 梯形带。紫杉醇在 50nmol/L以上浓度组均出现典型的 DNA 梯形带，它们大都出现在 200bp 附近(图 3)，证明紫杉醇作用后，细胞内内源性核酸酶活性增高，将核小体之间 DNA 切割形成规则的大片段以及 180200bp 的多聚体。并且随紫杉醇浓度的增大，DNA 梯形带越明显。说明紫杉醇诱导EJ 细胞凋亡具有浓度依赖性，诱导细胞凋亡可能为其抗肿瘤作用机制之一。这为今后紫杉醇用于膀胱癌治疗提供理论依据。参考文献81 Long HJ. Paclitaxel(Taxo
13、l):a novel anticancer che motherapeutic drug.Mayo Clin Proc,1994,69:3413452 FRANK G.E.PERABO,HEIKE LINDNER,DORIS SCHMID,DIRK HUEBNER.Preclinical Evaluation of Gemcitabine/Paclitaxelinteractions in Human Bladder Cancer Lines. ANTICANCER RESEARCH,2003,23:48054814.3 朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法.人民军医出版社,2000,252254.4 Milas L,Hunter NR,Kurdoglu B,et al.Kinetics of mitotic arrest and apoptosis in murine mammary and ovarian turmors treated with taxol. Cancer Che mother pharmacol,1995,35(4):297303.5 刘天佑, 曲欣,潘尚哈. 紫杉醇诱导体外培养胃腺癌细胞系SGC7901 凋亡.哈尔滨医科大学学报 ,2003,37(3):215217
