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1、1紫杉醇对 HEC1B 细胞凋亡诱导作用的实验研究【摘要】 目的： 探讨紫杉醇对体外培养的人子宫内膜腺癌细胞（HEC1B ）细胞凋亡的诱导作用 . 方法： 体外培养 HEC1B细胞，用浓度 2, 4, 8, 16, 20 nmol/L 的紫杉醇作用细胞 12 h，24 h， 48 h 后，提取细胞 DNA 片段进行琼脂糖凝胶电泳；消化HEC1B细胞并经碘化丙锭 (PI)染色后，流式细胞仪(FCM)对细胞进行细胞周期分析；电子显微镜对紫杉醇作用后的 HEC1B细胞进行形态学分析. 结果： 体外培养的 HEC1B细胞经不同浓度的紫杉醇处理后，细胞生长明显受到抑制；于 8 nmol/L 紫杉醇作用4
2、8 h 后可观察到细胞凋亡特异的 DNA 梯状电泳；流式细胞仪分析证实，细胞凋亡率达 19.7%；且电镜下可观察到典型的凋亡早期形态学改变. 结论： 人子宫内膜腺癌细胞（HEC1B ）细胞对紫杉醇具有药物敏感性，紫杉醇对 HEC1B细胞的杀伤作用，是通过诱导细胞凋亡途径实现的. 【关键词】 紫杉酚；子宫内膜肿瘤；腺癌； HEC1B； 细胞凋亡 【Abstract】 AIM: To investigate the inhibition of proliferation and the induction of apoptosis in in vitro cultured human endome
3、trial adenocarcinoma cell HEC1B by taxol. METHODS: Human endometrial adenocarcinoma HEC1B cells were cultured in vitro and treated with 2, 4, 8, 216, 20 nmol/L taxol for 12, 24, 48 h respectively. Isolated DNA fragments from HEC1B cells were analyzed by agrose ge1 electrophoresis. Apoptotic index in
4、 HEC1B cells stained with PI was detected with flow cytometer (FCM)assay. Electron microscopy was used to observe the morphological changes of HEC1B cells after treated with taxol. RESULTS: After treated with 8 nmol/L taxol for 48 h, DNA ladder tormation was observed in HEC1B cells. Typical apoptoti
5、c appearance was seen under an electron microscope. FCM assay revealed that the apoptotic rate was 19.7%. CONCLUSION: Taxol inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human endometrial adenocarcinoma cell HEC1B. 【Keywords】 paclitaxel; endometrial neoplasms; adenocarcinoma; HEC1B; apopto
6、sis 0 引言 子宫内膜癌(endometrial cancer, EC)是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的 20%30% . 在治疗方面一直沿用传统的手术或手术加放疗. 因此，疗效及治愈率无提高. 化疗在恶性肿瘤的治疗中具有重要作用，在晚期肿瘤的治疗中尤为重要. 近年来，子宫内膜癌的发病率有所上升，为了进一步提高子宫内膜癌的疗效，探索新的合适的化疗药物很有必要. 3紫杉醇(Taxol, Paclitaxe1)是 20 世纪 70 年代首先从美国西部紫杉中分离得到的，它在癌细胞分裂时能与细胞微管蛋白结合，促使细胞中微管稳定和聚合，使细胞有丝分裂受到阻断，从而抑制肿瘤生长
7、1. 早期在卵巢癌细胞的体外实验中发现，紫杉醇的细胞毒性与其诱发细胞凋亡有关2. 紫杉醇作为新一代化疗药物，其开发和应用已大大提高了卵巢癌的临床疗效. 为进一步明确其对子宫内膜癌的治疗作用，本实验在体外研究紫杉醇对 HEC1B细胞增殖的抑制作用和诱导凋亡作用奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料 HEC1B子宫内膜腺癌细胞株购自中科院上海生命科学研究院细胞所，紫杉醇购自北京四环医药科技股份有限公司. 噻唑蓝(MTF)，EMEM 培养基为美国 Gibco 公司产品. 1.2 细胞培养人子宫内膜腺癌细胞株 HEC1B培养于EMEM 培养液中(含 100 mL/L 胎牛血清, 1.0 mmol/L
8、 丙酮酸钠，1.0 mmol/L 非必需氨基酸和 1.5 g/L 碳酸氢钠，pH 7.07.2) ，于37, 50 mL/L CO2 培养箱中培养，每 48 h 换液一次. 细胞呈单层贴壁生长，2.5 g/L 胰蛋白酶消化传代. 选用对数生长期细胞进行实验4-5 . 1.3 细胞增殖活力检测将贴壁细胞消化传代后计数，调整细胞浓度为 1104/mL，接种于 24 孔培养板中， 37, 50 mL/L CO2 及饱和湿度条件下培养 . 实验时分为 2, 4, 8, 16, 20 nmol/L 54个药物浓度组及对照组，每组 5 个孔，细胞接种后 24 h 加药，分别于加药后 12, 24, 48,
9、 72 h 测定各孔的吸光度值（A 值）. 测定前弃去培养孔上清后，每孔加 500 L新配制的 5 g/L MTT，37 继续孵育 4 h，弃上清加 150 L DMSO 溶解，混匀后用 DG3022 型酶标仪，在 490 nm 波长处测定细胞的光吸收值，并按肿瘤细胞抑制率=(1-实验孔 A 值/对照孔 A 值)100%. 1.4 紫杉醇对细胞超微结构的影响收集浓度为 8 nmol/L 的紫杉醇作用 48 h 的细胞及对照组细胞，PBS 洗涤 2 次，离心后弃上清，先加入 30 g/L 戊二醛固定，后 10 g/L 的锇酸固定 50 min，脱水、包埋、聚合，按常规方法制备电镜超薄切片，醋酸双
10、氧铀和硝酸铅染色，透射电镜观察细胞超微结构. 1.5 琼脂糖凝胶电泳收集上述细胞，调整浓度为1107/mL，离心，弃上清，溶解于 500 L 细胞核裂解液中作用 4 h, 4 12 000 g 离心 15 min，收集上清 0.5 mL 平衡酚抽提，混匀，离心 15 min 收集上清，加 0.5 mL 氯仿，异物醇抽提，混匀，离心15 min，收集上清，加 50 L 乙酸钠和无水乙醇 2 mL 混匀，-20 过夜，离心沉淀 10 min，弃上清，加 80 L 的 TE 和 2 0 L的RNase 5 L置 37孵育 2 h，取 20 L 加上样缓冲液 5 L 上样，15 g/L 琼脂糖凝胶电泳
11、，35 V 电压 1.5 h，紫外灯下观察 . 1.6 流式细胞仪分析 8 nmol/L 的紫杉醇处理后的细胞培养48 h 后，经常规预处理后，流式细胞仪(FCM)测定亚二倍体峰及各个细胞周期细胞凋亡情况. Multcycie 软件处理结果后. 以未加药者5为对照组. 2 结果 2.1 紫杉醇对人子宫内膜腺癌细胞（HEC1B ）的生长抑制作用 216 nmol/L 的紫杉醇分别作用 l2， 24， 48， 72 h 后，对肿瘤细胞生长抑制作用结果表明： 随着剂量增加，细胞存活率降低，有明显的剂量依赖关系； 24 h 后，6 nmol/L 以上浓度的紫杉醇具有明显抑制细胞生长的作用. 48 h
12、后最低抑制浓度为2 nmol/L，随着时间的延长，药物的敏感性增加，同一剂量的药物有时间依赖关系(图 1). 图 1 紫杉醇诱导 HEC1B 细胞凋亡抑制率（略） 2.2 电镜观察结果对照组正常肿瘤细胞生长旺盛，核大且不规则，胞膜完整，胞质内细胞器丰富，清晰，线粒体、内质网丰富，部分可见细胞分泌，长的可见线粒体 表示细胞连接好（图 2A） ；在药物作用浓度 48 h 后，出现了细胞早期凋亡，肿瘤细胞染色质固缩，聚集在核膜周边成新月形，线粒体肿胀、脊断裂，出现凋亡小体（图 2B）. 晚期凋亡细胞器崩解，细胞线粒体，内质网都有所改变，核固缩（图 2C）. 2.3 琼脂糖凝胶电泳结果当紫杉醇的浓度为
13、 8 nmol/L 时，作用 24, 48 h 后，电泳结果清楚显示 DNA 梯形带(图 3). 2.4 流式细胞仪分析 HEC1B经紫杉醇作用、PI 染色后，流式细胞仪进行分析显示：细胞因增生受抑制会出现明显的 G13.1百分比增高，G2/M+S 百分比降低. 8 nmol/L 的紫杉醇作用 48 h6的细胞有明显凋亡峰(图 4A). 未经紫杉醇处理的对照组细胞G15.7，峰前无凋亡峰或坏死细胞的峰，无亚二倍体峰出现(图 4B). A： 对照组； B，C： Taxel 组. 图 2 紫杉醇处理后 HEC1B细胞的超微结构变化（略） 图 3 紫杉醇处理后 HEC1B细胞 cDNA 琼脂糖凝胶电
14、泳（略） A: Taxel 48 h; B: 对照组. 图 4 紫杉醇处理后 HEC1B细胞周期性变化（略） 3 讨论 细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，是细胞主动参与的“自杀”机制. 近年来的研究表明，许多抗肿瘤药物均可诱导肿瘤细胞凋亡这也可能是抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞生长的机理之一6. 化疗药物主要通过诱导癌细胞的凋亡达到治疗目的，癌细胞对化疗药物的敏感性决定了抗癌的有效性. 紫杉醇是一种新型抗肿瘤药物，作用的目标是细胞骨架的微管系统，促进微管聚合并稳定微管结构，阻止其解聚成亚单位，进而影响到微管聚合与解聚的动态平衡，诱导多种肿瘤细胞发生凋亡7. 我们对紫杉醇处理的人子宫内膜腺癌细胞（
15、HEC1B ）进行了检测，发现紫杉醇对其具有显著的生长抑制作用，并且存在着有明显的剂量依赖关系. 通过超微结构的分析，多核细胞的各核内均可见染色体凝集，并呈新月7状附着于核膜，进一步证实多核细胞为早期凋亡细胞. 另外，电镜观察可见经紫杉醇诱导后有凋亡小体、髓样小体、多泡体等结构出现. 髓样小体、多泡体病理上多见于受损及衰老细胞，因此形态学的表现提示紫杉醇具有明显的细胞毒性和促凋亡作用. 同时，流式细胞仪分析观察到细胞凋亡相关的亚二倍体峰型，其作用机制主要表现为 DNA 合成期及 G2M 期阻滞和一定数量的细胞凋亡. 这与相关8研究的紫杉醇对人胆管癌细胞的作用相似. 内源性核酸内切酶激活、DNA
16、 断裂是细胞凋亡的重要过程. 本实验中，琼脂糖凝胶电泳显示：加药组细胞 DNA 呈明显的梯状带，证明紫杉醇作用后细胞内内源性核酸酶活性增高，将核小体之间DNA 切割形成 180200 bp 的多聚体. 说明经紫杉醇诱导产生的细胞核内有广泛的 DNA 断裂，属凋亡的早期改变. 以上结果都证明紫杉醇能够对人子宫内膜腺癌细胞（HEC1B ）产生细胞凋亡诱导作用. 恶性肿瘤治疗的另一大障碍，是对化疗药物的耐药性问题9. 使肿瘤细胞逃逸化疗药物的杀伤，紫杉醇对正常细胞的副作用小，对肿瘤细胞的直接杀伤作用强；与化疗药物之间无交叉耐药，且有明显的协同作用. 研究证实，紫杉醇通过调节细胞凋亡相关基因的表达、启动肿瘤细胞凋亡信号通路，抑制肿瘤细胞的增生，抑制其侵袭性转移，最终杀伤肿瘤细胞10 . 因此，进一步明确紫杉醇
