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1、1紫杉醇和吉西他滨对鼻咽癌 HNE2 细胞系 协同放射增敏的作用【摘要 】 目的 观察紫杉醇、吉西他滨两药联合对鼻咽癌细胞系HNE2 的放射增敏作用，并探讨其可能机制。方法 将 HNE2 细胞分为单纯照射组、吉西他滨（GE）照射组、紫杉醇（PA）照射组及 GE+PA+照射组，用克隆形成实验计算两药物单用及合用的放射增敏比，流式细胞仪法分别检测、比较各组的细胞凋亡率及细胞周期变化。Western blot 法测定各组细胞凋亡相关基因bcl2、bax 的表达水平。结果 吉西他滨、紫杉醇及两药联合使用的放射增敏比分别为 1.06、1.13 和 1.34。流式细胞仪检测显示吉西他滨联合射线主要诱导 S
2、 期阻滞（96.03） ，诱导凋亡率为31.62；紫杉醇联合射线引起的阻滞以 G2M 期为主（75.71% ） ，诱导细胞凋亡率为 44.56%；两药合用并联合照射后 G2M 期比例（65.98%）有所下降，同时 S 期比例（33.33%）有所上升（与PA+放射组比较） ，细胞凋亡率达到 73.28%。在四组中 bcl2的表达呈逐步下降趋势，而 bax 的表达则呈逐步上升趋势。结论 吉西他滨、紫杉醇单用及两药联合对鼻咽癌细胞系 HNE2 均有放射增敏作用，且两者协同增敏作用显著高于单独增敏作用，显示了两药联合应用有助于提高鼻咽癌的放射敏感性。两者协同放射增敏作用的机制可能与凋亡有关。 2【关键
3、词】 紫杉醇 吉西他滨 鼻咽癌 放射增敏0 引言放射治疗一直是治疗鼻咽癌的首选方法。近年来已有作者报道分别将紫杉醇1（Paclitaxel，PA）和吉西他滨2（Gemcitabine，GE）联合放射治疗鼻咽癌，以增加其放射敏感性，但两药联合使用增加放射敏感性的报道尚属少见。本试验选用鼻咽癌细胞株 HNE2 作为研究对象，研究了紫杉醇和(或)吉西他滨联合放射对 HNE2 细胞增殖、凋亡的影响，以探讨 PA 和 GE 协同作用对 HNE2 细胞的放射敏感性的影响及其可能机制。1 材料和方法1.1 细胞株、药物和试剂 人鼻咽癌 HNE2 细胞株购自湖南湘雅医学院肿瘤研究所。紫杉醇和吉西他滨分别为美国
4、百时美施贵宝公司及礼来公司产品。兔抗人多克隆第一抗体及生物素标记的第二抗体由北京中山生物技术有限公司提供，系美国 Santa Cruz 产品。噻唑蓝（MTT ） 、二甲基亚砜（DMSO）购自 Sigma 公司，RPMI1640 、胰蛋白酶购自 GIBCO 公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。31.2 细胞及培养条件 人鼻咽癌 HNE2 细胞株培养于含有 10%胎牛血清的 PRMI1640 培养基中，添加 100IU/ml 青霉素及链霉素，37、100%湿度、5%CO2 条件下常规培养。1.3 MTT 法测定药物 IC50 及 IC10 值 HNE2 细胞按 103/孔接种于 96 孔培养板，待
5、1618h 后贴壁生长至对数生长期时，将 PA用培养基依次稀释为500g/ml、50g/ml、5g/ml 、0.5g/ml、0.05g/ml 、0.005g/ml，分别按 100l/孔加入 96 孔板，每一浓度设 3 复孔，并设正常对照孔及空白调零孔。同法将 HNE2 细胞按 5103/孔接种于 96孔培养板，GE 依次稀释为2000g/ml、200g/ml、20g/ml、2g/ml、0.2g/ml、0.02g/ml 加入 96 孔板。置 37培养箱孵育 24h 后，弃去药物及陈旧培养基，每孔加新鲜配制的 MTT（5mg/ml）20l 再次孵育 4h，弃去 MTT 液，每孔加 DMSO150l
6、，振荡 15min，酶联免疫检测仪于 490nm 波长测定吸光度 D。重复 3 遍。肿瘤细胞抑制率（1 实验组吸光度/对照组吸光度）100%1.4 克隆形成实验测定药物放射增敏性 将正常细胞、GE 作用24h 后细胞、PA 作用 24h 后细胞及两药联合作用（浓度同上）24h 后细胞组常规消化后分别按不同照射剂量以不同密度接种于460mm 培养皿，每组细胞给予 6MV X 射线单次照射0、2 、4 、 6、8Gy ，恒温箱中培养 12d。12d 后取出培养皿，弃去培养基，PBS 清洗 2 遍，甲醇固定 15min，去除固定液，姬姆萨染色 30min，对含 50 个细胞以上的克隆进行计数。多靶单
7、击模型拟合细胞存活曲线并计算增敏比。1.5 流式细胞分析 将培养于 50ml 培养瓶中呈对数生长的 HNE2细胞随机分为：（1）单纯照射组、 （2 ）GE 放射组、 （3）PA放射组、 （4）两药联合放射组。单纯照射组仅给予 6Gy 照射，其余三组分别给予 GE（0.2g/ml） 、PA（0.1g/ml）及 GE 和 PA 的混合液作用 24h 后弃药并照射 6Gy。以上四组共同孵育 24h，常规消化后 800r/mim 离心 5min，弃上清，PBS 清洗 2 遍，80%乙醇4固定过夜，离心去乙醇， PBS 清洗 2 遍，用 RNase（终浓度0.02mg/ml） 、PI（终浓度 0.1mg
8、/ml）及 0.3%的 TritonX100混合配制成的 PI 染液避光染色 30min，流式细胞仪分析细胞周期及凋亡情况。1.6 Western Blot 法测定 bcl2、bax 的表达 分组及每组处理方法同 1.5，将四组细胞常规消化后置 EP 管 800r/min 离心5min，弃上清，PBS 清洗 2 遍，每管加新鲜配制的裂解液100l，4裂解 30min，随后 4 12 000r/min 离心 15min，吸上清，每个样本均分装成 5l及 60l两管，20保存。将 5l/5管蛋白加上样 buffer 沸水煮 5min，BCA 法测样本蛋白浓度。用15%的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分
9、离样本蛋白，电转移至硝酸纤维素滤膜上，与兔抗人 bcl2 及 bax 多克隆抗体 4孵育过夜。次日加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育 1h，ECL 显色，X 射线片显影。实验重复 3 遍。1.7 统计学处理 所用数据均以均数 标准差表示，结果用SPSS13.0 统计软件进行 t 检验。2 结果2.1 GE 及 PA 的 IC50 和 IC10 值 MTT 实验表明不同浓度梯度的PA 及 GE 作用细胞 24h 后，细胞抑制率随药物浓度的增加而增加，结果见表 1。应用 IC50 计算软件求出 GE 的 IC50 及 IC10 分别为173.2g/ml和 0.210g/ml。PA 的 IC50
10、及 IC10 分别为2.73g/ml和 0.13g/ml。以下的实验均选用两种药物的大致IC10 浓度 0.2g/ml（GE）和 0.1g/ml（ PA） 。表 1 GE 及 PA 对HNE2 细胞的生长抑制作用2.2 GE、PA 及 GE+PA 对细胞放射敏感性的影响 将正常细胞、GE、PA 作用后细胞及两者联合作用后细胞分别给予0、2 、4 、 6、8Gy 射线照射后多靶单击模型拟所得结果如图 1。单6纯对照组细胞存活曲线的 D0=3.17，Dq1.73；GE 组的D0=2.99， Dq1.52；PA 组的 D0=2.8，Dq1.44；联合用药组的存活曲线与前三组相比明显下移，肩峰变窄，D
11、0=2.37， Dq1.07。吉西他滨的增敏比（单纯照射组 D0 与吉西他滨组 D0 之比值，以下类推）为 1.06，紫杉醇的增敏比为 1.13，而两药联合后的增敏比为 1.34，明显高于两药分别使用时的增敏比(P0.05)。2.3 不同处理对细胞周期及细胞凋亡的影响 图 2 显示四组细胞经不同处理后的细胞周期分布。单纯照射 6Gy 引起的阻滞以G2 M 期（36.920.76 ）%为主；紫杉醇联合照射可进一步诱导G2 M 期阻滞（75.710.51 ）%；吉西他滨联合射线引起的阻滞以 S 期（96.030.25 ）%为主；两药联用并联合放射后 G2M 期比例（65.980.59）%有所下降，
12、同时 S 期比例（33.330.73）%有所上升（与 PA+放射组比较） 。图 3 显示四组细胞经不同处理后均出现不同程度的凋亡，其中以 PA+GE+放射组最为明显（73.280.37）%，显著高于其中任一单药联合放射后引起的细胞凋亡率（31.620.64）%或（44.560.62）%,P0.05。2.4 对 bcl2 及 bax 表达的影响 Western Blot 检测得到 bax在 GE+PA+放射组、 PA+放射组、GE+放射组及单纯照射组各组中的表达呈逐步下降趋势，而 bcl2 在上述各组中的表达呈逐步上升7趋势，见图 4、5。3 讨论鼻咽癌的治疗目前仍以放射治疗为主,早期鼻咽癌通过
13、放射治疗可以取得良好的疗效，但、期单独放射治疗的疗效仍较差，其五年存活率仅为 30%55%3。局部复发与远处转移是治疗失败的主要原因，因此探讨放化疗合理的联合应用以提高 NPC 治愈率是目前研究的重点之一。吉西他滨是一种新的脱氧胞苷类似物，在体内及体外实验中已进行了对非小细胞肺癌、胰腺癌及头颈部肿瘤的放射增敏性研究，取得了很好的疗效2,4,5。其放射增敏的作用机制为6：使细胞周期重分布，周期敏感细胞增加；直接渗入细胞 DNA，抑制其修复；使细胞 dATP 池耗竭，影响细胞 DNA 生物合成，导致细胞凋亡。紫杉醇是一种新型抗微管药物。国外研究表明紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌7及头颈部肿、非小细胞肺癌
14、1,8等多种实体瘤细胞有放射增敏作用。但其确切作用机制仍不十分清楚。其中一个可能的机制是其通过抑制微管蛋白解聚使细胞阻滞于 M 期，因而也就提高了细胞的放射敏感性7 。本实验研究显示，吉西他滨对细胞周期的影响是将其阻滞于 S 期，而紫杉醇则是将其阻滞于 G2M 期，与文献报道相似9,10 。同时8研究还发现，两药协同作用后 G2M 期细胞比例有所下降，S 期细胞比例增加，表现为吉西他滨部分逆转了紫杉醇所致的 G2M 期阻滞，但两药协同使 HNE2 细胞的总细胞周期进展得到显著阻滞，明显增强了它们抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡的作用，大大提高了其对肿瘤细胞的放射增敏作用。因此通过本实验证实了吉西他滨
15、和紫杉醇协同作用使其同时从两个不同途径共同作用，诱导了鼻咽癌HNE2 细胞的凋亡，显著提高了细胞的放射敏感性。细胞中 bax 与 bcl2蛋白的比例似乎可调控凋亡的发生11。研究发现在抗肿瘤药物诱导的细胞毒性中，凋亡是一个非常重要的现象。抗肿瘤药物诱导凋亡的分子机制是通过死亡受体依赖性和非依赖性通道介导的，与线粒体内膜上的电压依赖性阴离子通道释放的细胞色素 C 密切相关的，而细胞色素 C 的释放是通过包括Bid、bax 和 Bak 在内的促凋亡蛋白和包括 bcl2 和 bclX(L)在内的抗凋亡蛋白的相互作用来调控的12。本研究显示吉西他滨或紫杉醇与辐射联用均可使 bcl2的表达下降，而使 b
16、ax 的表达上升，两药协同作用联合辐射后可进一步使 bcl2的表达下降，而使 bax的表达上升，说明两者协同作用并联合辐射后可进一步促进肿瘤细胞凋亡，提示两者协同显著增强鼻咽癌 HNE2 细胞的放射敏感性的机制可能与促进细胞凋亡及调控 bax/bcl2的表达有关。总之，本实验证明抗肿瘤新药吉西他滨与紫杉醇协同作用可以促9进鼻咽癌 HNE2 细胞凋亡，抑制其细胞周期的进展，下调 bcl2的表达并上调 bax 的表达，显著增强鼻咽癌 HNE2 细胞对射线的敏感性，从而为临床上同时利用两药协同射线治疗鼻咽癌提供了重要的实验依据。【参考文献】 1 Bucci MK, Rosenthal DI, Hershock D. Final report of a pilot trial of ac
