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1、第三章 微生物检测用标准物质的使用及管理,教学目标： 熟知微生物检测用标准物质的使用及管理、了解抗生素效价复核。教学重点： 微生物检测用标准物质的使用及管理教学难点：抗生素效价复核,一、概述二、抗生素标准品三、微生物菌种的使用、保存与管理、验证四、细菌内毒素标准品与鲎试剂,第三章 微生物检测用标准物质的使用及管理,一、概述 标准物质是用来标定仪器，验证测量方法或鉴定其他物质的，是有一种或多种性能的材料物质。而药品标准物质是执行药品标准的基础，它是用于检查药品质量的一种特殊的专用量具，是一类与其它领域不同的特殊标准物质。,标准物质,生物标准物质化学标准物质,不同的使用对象与测定方法,根据使用要求
2、不同,国际、国家、工作用三级标准物质,生物标准物质是用于那些不能用化学或物理量表示强度，而只能用生物方法测定效价的品种。只有当被测物质纯度提高，结构清楚后用理化方法控制质量分析条件成熟后，该品种的化学测定用标准物质即应建立，生物标准物质则完成其使命而停用。,医药工业微生物检验室常用的标准品或对照品,(1) 用于抗生素效价测定的抗生素国家标准品、工作标准品；,(2) 用于鲎试验的细菌内毒素国家标准品、工作标准品；,(3) 去热原工艺验证用细菌内毒素验证品；,(4) 微生物检验用标准菌株或菌种和生物指示剂等对照物质。,标准品或对照品的一般控制包括,(一) 标准品和对照品的来源,通过采购供应部门向中
3、国药品生物制品检定所购买,由生产厂商提供的标准品、对照品，必须经省级以上（含省级）药检所标化认定，或必须提供标明该物质有关质量指标的品质证书。,(3) 经中国药品生物制品检定所认可的部分外国制药企业的药品检查用标准品或对照物质，可直接向国外生产厂家索取。,(二) 标准品、对照品的保管,(1) 微生物检验室指定专人负责标准品、对照品的保管。(2) 订购的标准品或对照品到货后，由负责标准品或对照品保管的人员检查验收并及时填写标准品、对照品接收及使用记录。记录内容应包括：编号、品名、批号、来源、数量（支）、购进日期、领用数量、领用日期、领用人、结余、备注。,(三) 标准品、对照品的存储和领用 (1)
4、 微生物检验室的标准品和对照品应置于冰箱中存储，必要时可用专用冰箱并加锁存储，抗生素标准品还必须用-20的低温冰箱存储，并由专人每周（冷冻）或每天（冷藏）登记冰箱温度，如遇停电情况应于次日记录温度并评估可能会对标准品或对照品造成的影响。(2) 检验人员若需要使用标准品或对照品，应向管理员提出，由管理员按先进先出的原则取出标准品或对照品交给检验人员，并由检验人员和管理人员及时在标准品、对照品接收及使用记录上的领用数量、领用日期、领用人、结余项进行记录。,(四) 标准品或对照品的销毁及使用记录 标准品或对照品使用完毕或过期之后都应及时销毁，并在标准品、对照品接收及使用记录上填好销毁及使用记录。,(
5、五) 定期对标准品或对照品进行抽样检查 定期抽样检查至少每季度1次，应填写标准品或对照品检查表 并归档保存，标准品或对照品检查表的内容为：检查日期、抽样品名、批号、登记数量、实际数量、品质证书（有、无）存储条件（对、不对）、冰箱温度计录（有、无）、管理员签名、检查员签名。,(六) 特殊的标准品菌种,二、抗生素标准品,() 使用与保存,由冰箱中取出的标准品或对照品在使用时，必须先置干燥器中放置至少30 min，使与室温平衡防止吸湿。特别应注意在标准品安瓿管的开启中注意避免带入玻璃屑和水分。开启后应立即将标准品转移到预先洗净、晾干并于105干燥2 h后置干燥器中保存至室温的西林瓶中，立即用同样处理
6、过的橡胶塞盖紧瓶口，用胶带封口，置有硅胶的干燥容器中，再保存于-20的低温冰箱中。,1. 安瓿管的开启,2. 标准品称量,3. 标准品接收、贮存和配制,砂轮安瓿管颈部割痕，取环形针拉直，弯曲成半圆形钩，在酒精灯火焰中烧红后立即紧贴套在颈部割痕处，直至听到割痕处发出轻微的爆裂声。取下半圆形钩，用手轻轻完整地掰开安瓿管头部，可避免带入玻璃屑。,称量要1/10万的分析天平，应预先计算好稀释步骤，包括所用容量瓶的毫升数、所用溶剂、称取标准品的量。称取量一般不得低于15 mg。由于抗生素吸湿性强，称量时极易吸潮，因此操作要快，不必苛求精确重量，不超过预定重量的5%。然后，在稀释步骤中予以校正到一定的浓度
7、。称量时禁止用药勺等工具伸入标准品的容器中取用，以免污染标准品。,应有完善的文档管理。配制记录中应包括以下：标准品品名、来源、批号、纯度、称量数量、天平编号型号、配制日期、贮存条件、有效期（如需要）、干燥条件（如需要）、稀释剂及相关配制记录、以及配制人。贮备液的容量瓶外面务必标明名称、来源、浓度、配制日期、效期、存贮条件以及配制人姓名。,(二) 抗生素效价复核,必须按中国药典抗生素微生物检定法中的三剂量法要求对工作标准品进行效价复核实验。每次实验均应称取2份国家标准品和2份需测工作标准品进行平行试验，每组实验应不少于9个平皿，实验结果的可信限率应不得大于 5%，结果取平均值。该实验需反复多次地
8、在不同操作人员间进行，以积累充分多的数据满足统计需要。最后，将所得结果进行统计合并计算（不是求平均值，具体方法可参见本书第八章的内容或中国药典生物检定统计法中的实验结果的合并计算），才能得出被测工作标准品较为客观的效价。各实验室自行标定的工作标准品只能在本室内使用。,复核试验应由具有一定实验操作经验的人员进行。根据所要分析的抗生素类型，来确定采用管碟法还是采用比浊分析法。本文以管碟法为例，介绍工作标准品的复核和评价方法。 按中国药典(2005版)要求，用标准贮备液稀释制备3种不同浓度的标准液，如80%、100%和125%。这3种浓度的对数值间是等距离的，因此在检测结果的统计学计算中可采用一常数
9、表示。国家标准品的浓度分别用U1、U2和U3表示低、中、高3种浓度。 本法采用随机编码方式，在平皿内的琼脂培养基表面摆放6个不锈钢小管，向每个管内加入不同浓度的溶液。每个工作标准品的称量样品要求做12只平皿。在规定条件下培养，培养时间结束后，目测检查每个平皿，看是否抑菌区不正常或不含抑菌区的平皿，并剔除不正常的平皿，从目测结果良好的平皿中随机选取其中的9只，用适当的仪器(如zy-300IV多功能微生物自动测量分析仪)准确量出每个抑菌圈的直径。,无论是在进行抗生素效价复核还是平时进行效价的正式测定操作之前，都应先进行菌液浓度的预测试验。其目的是选择适宜的菌液浓度，使被测抗生素标准品溶液所致的抑菌
10、直径在中国药典规定范围内，2.2法标准品溶液高浓度所致的抑菌圈直径在1824mm；3.3法标准品溶液中心浓度所致的抑菌圈直径在1518mm。,其操作方法是：,(1) 按无菌操作往双碟内加入加热融化后的底层培养基20ml，用陶瓦盖覆盖，待其凝固。 (2) 取加热融化后的菌层培养基20ml，待其降至规定温度将试验菌加入培养基内，摇匀，吸取5ml均匀摊布在底层培养基上，用陶瓦盖覆盖，静置约1020min。（3）在制备好的双碟上等距离放置小钢管23个，在小钢管内滴加欲测抗生素的标准溶液。（4）滴加完毕，用陶瓦覆盖，小心移置培养箱内，按规定的温度和时间进行培养。（5）取出培养好的双碟，用卡尺测量抑菌圈直
11、径。若所试抑菌圈直径超过规定范围，可调整加菌量或调整抗生素标准品溶液的浓度，重新测试。,1. 管碟法的统计学分析方法,(1) 列举出管碟法的原始数据和数值范围包含了一组国家标准品与一组工作标准品进行对比试验的所有原始数据。将最高值减去最低值便得出每一例的数值范围。比率（R）计算，R数值范围的最高值所有数值范围的总和。最大范围与所有范围的总和的比率应不超过0.273（针对9个平皿的分析试验并且P=0.05）。倘若超过了该值，则要检查列中最大范围的异常反应。(2) 确定抑菌圈直径测量值是否异常值如果某平皿的抑菌圈直径测量值异常，应该根据中国药典(2005版)生物检定统计法中所讲述的特异值剔除方法进
12、行计算，以后再判断该平皿是否保留或剔除。,(3) 计算效价的对数值、效价的百分（p）,只有至少6个平皿的所有数据均完整无缺时，方可进行计算。将表中的所有数据分别进行横向和纵向相加，按如下方法计算效价的对数值。 (U1+U2+U3-S1-S2-S3)= S3+U3-S1-U1 为一常数,取决于各剂量的比率（表3-1）。例如，如果浓度为80、100、125，比率为1：125，相应地该常数为012921。对大多数抗生素而言，不管是采用管碟法，还是比浊法，进行复核试验时建议采用1：125比率。效价的百分比（p）计算：p100Lg1M,表31:三剂量分析的效价和L/2常量,(4) 按中国药典(2005版
13、)生物检定统计法进行可利用测验和效价计算。,(四) 效价复核数据的计算机统计处理 见第八章的四、量反应平行线测定随机区组设计（3.3）法的微机运算。,(三) 效价复核数据的统计学分析实例,三、微生物菌种的使用、保存与管理、验证,微生物菌种的使用、保存与管理是微生物检验室的一项重要工作，检验室必须保藏一批形态、生物化学、血清学特性稳定的标准对照菌株，以便用于药典规定的无菌检查、微生物限度检查、抗生素微生物（效价）测定及测定、评价防腐剂和抗菌剂的抗菌效果，以及确认灭菌工艺的效果、检验方法的验证、培养基的促菌生长能力（灵敏度）、样品检验时的阳性对照等许多的检测工作中。因此，菌种是微生物实验使用频率最
14、高的对照物质，相当于在化学或者仪器分析中使用的标准品。微生物实验室对菌种的管理除了与化学标准品一致的管理要求外，还因微生物的特性决定有特殊的要求。菌种是活的微生物，在菌种的使用保藏过程中需定期传代，并防止变异；因此，菌种保藏和传代是微生物检验工作中的一项重要技术。不然的话，因菌种管理不善，将会给试验结果带来很大的差异，给生产带来重大影响。下面分述有关事项。,(一) 制定菌种使用、保藏管理程序,微生物检定室应制定出本室菌种的使用、保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、使用、保管、接种传代，存储和领用等方面的要求，确保菌种溯源性和稳定性；防止试验用菌种因使用过程中多次传代而失去典型生物学特征发生变异
15、或死亡，保证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。,1做好菌种的来源登记，确保溯源性清楚,标准菌株,2菌种的接收与复活,一般包括以下几个步骤：,(1) 冷冻菌种的复活,假如在该平版上发现有其他菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯。要将该污染培养物作灭菌处理，寻找原因，重新分离挑选纯菌落。,(二) 严格控制菌种的传代、做好保藏工作,中国药典（2005年版）做出“菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）”,另外我国CMP认证中对传代次数也有要求，要按照实验室制定的菌种使用与管理规程进行传代与保藏。各个微生物实验室放弃传统单一的斜面传代保存法，用简便易行的方
16、法来传代保藏（见后述），保证菌种的长期有效，避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。,图3-1:菌种的传代保藏方法与工作用菌种示意图,(三) 常用菌种保藏方法,众所周知，微生物具有容易培养易于变异的特点，因此必须采用合适方法保藏菌种。菌种保藏最基本的原理是：创始一些不利于其生长繁殖的条件，使其代谢与生长处于最不活跃或相对静止状态，从而在一定时间内不发生变异并保持生命活力。一般来说低温、干燥或缺乏营养、隔绝空气（厌氧）对好氧微生物而言是使微生物代谢能力降低的重要因素和条件，菌种保藏方法都是依据这些因素制订的。下面介绍几种简便而又实用的菌种保藏方法，一般条件的试验室都可以实施。,1. 甘油冷冻管保藏法其保藏原理是低温或缺乏营养。,待保藏菌接种至平板或琼脂斜面，适宜温度下培养适宜时间后（细菌需要2448 h的培养物，酵母菌需要72 h的培养物，形成孢子的微生物则宜保藏孢子，放线菌和丝状真菌则应培养710 d），,
