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1、一氧化氮合酶各种亚型的信号通路对心力衰竭的作用机制与治疗的研究进展 金春花 刘文博 关宏锏 金春子 延边大学附属医院妇科 延边大学附属医院心内科 延边大学附属医院神经内科 摘 要： 一氧化氮 (NO) 是心脏的一种重要的信号分子, 它是由三种 NO 合酶 (NOS) 即神经型 NOS (NOS1) 、诱导型 NOS (NOS2) 和内皮型 NOS (NOS3) 产生的内源性物质。NO 信号通过环鸟苷酸 (c GMP) 依赖途径或非依赖途径进行翻译后修饰 (即 c GMP 依赖的蛋白激酶磷酸化, 巯基-亚硝基化等) 从而调控下游蛋白。NOS的功能障碍 (即表达、定位、耦合和活性的改变等) 存在于
2、各种心脏疾病中 (如心力衰竭) , 导致了收缩功能障碍及心室重构和肥大。本文将重点阐述在健康和疾病状态下 NOS 各种亚型的信号通路, 并讨论现有的和潜在的方法通过靶向 NO 通路来治疗心力衰竭。关键词： 综述; 一氧化氮合酶; 心力衰竭; 作者简介：金春花 主管护师学士主要从事妇科疾病与心力衰竭方面研究Email:作者简介：金春子 Email:基金：国家自然科学基金 (81460039) 一氧化氮 (NO) 是由 NO 合酶 (NOS) 蛋白家族合成的多种功能性调节气体。在哺乳动物中, 有三种 NOS。1995 年 Balligand 等以及 1999 年 Xu 等提出, 神经型 NOS (
3、NOS1) 和内皮型 NOS (NOS3) , 在心室肌细胞中的表达方式为结构型表达, 而诱导型 NOS (NOS2) 的表达受环境因素影响 (例如细胞因子的产生受免疫应答影响) 。通过 NOS1 和 NOS3 生成的 NO 是钙依赖型, 而 NOS2 生成的 NO 是钙通道/钙调蛋白非依赖性的。NOS 是由两个同源单体组成的二聚体。NOS 二聚体的 C 端 (还原酶结构域) 包括黄素单核苷酸 (FMN) 、黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 结合位点和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH) , 而 N 端 (氧合酶结构域) 由 L-精氨酸、四氢生物蝶呤 (BH 4) , 游离氧 (O 2
4、) , 亚铁血红素基团组成。另外钙调蛋白结合位点位于氧合酶结构域和还原酶结构域之间。黄素的作用是将 C 端 (还原酶结构域) 的电子转移到另一 N 端 (氧合酶结构域) , 通过氧化 L-精氨酸而生成 L-瓜氨酸和 NO1。氧化应激状态下, NOS 的产物 O2中断了 NO 的产生并代替了 NO, 使 NOS 长期解偶联。BH4 是结合与血红素氧化酶域促进 L-精氨酸生成 NO, 但消耗或氧化 BH4时可以使电子从还原酶结构域流向氧合酶结构域而使氧生成 O2-2。此外, NOS3 中的谷胱甘肽化在半胱氨酸 689 和半胱氨酸 908 阻断剂的作用下 NADPH 还原为 NADP, 从而导致在还
5、原酶结构域中生成 O2。有报道表明, ONOO 的毒性也同样使 NOS3 解偶联3。因此, 在心肌细胞中, NOS 主要生成 NO。然而, 在疾病的条件下, NOS 也能导致 O2的生成和 ONOO 水平的增加4。1 NOS1 信号1989 年 Knowlese 等在大脑中首次发现 NOS1, 被命名为 n NOS。然而, 这种酶在各种细胞类型 (包括心室肌细胞) 中表达, 因此又称为 NOS1。NOS1 在心肌中主要存在于心肌细胞的肌质网 (SR) 中, 但也存在于线粒体、高尔基体和细胞膜中1。1999 年, Xu 研究团队发现 SR 中表达 NOS1。这种被表达的 NOS1 能够控制肌质网
6、钙泵 (SERCA) 而调节细胞内钙离子的重吸收5。显然, NOS1 源性NO 是心肌细胞中钙离子的调控中至关重要的调节因子。通过使用 NOS1 基因敲除和心肌细胞特异性 NOS1 表达模型与 NOS1 抑制剂的结合发现, 正常心肌中NOS1 产生的 NO 对正常心脏的收缩和舒张起着调节作用。是由 NOS1 产生的 NO通过环鸟苷酸 (c GMP) 依赖机制, 调节心肌细胞膜中的 L 型钙通道的活性, 以减少细胞内大量的一过性钙离子内流, 从而调控细胞内钙超载。相比之下, 细胞内的 Na/Ca 交换则不受影响6。在 SR 中, NOS1 源性 NO 促进心肌舒张, 是通过增加蛋白激酶 A (P
7、KA) 依赖的受磷蛋白的磷酸化位点 16 丝氨酸 (P-SerPLN) 和 Ca/钙调蛋白依赖激酶 (Ca MK) -依赖的受磷蛋白的磷酸化位点 17 苏氨酸磷酸化 (P-ThrPLN) 来促进肌质网钙泵 (SERCA) 对钙的重吸收, 继而抑制蛋白磷酸酶 2A 和蛋白磷酸酶 1 的活性6。Jin 等7研究发现在疾病心脏中 NOS1 通过 PKG 依赖的心肌肌钙蛋白 I 的磷酸化位点 23/24 丝氨酸 (c Tn I) 和心脏肌球蛋白结合蛋白 C 的磷酸化位点 273 丝氨酸 (c My BP-C) 的磷酸化抑制肌丝钙敏感性, 导致细胞内游离钙离子增多, 继而使 SR 的钙重吸收也增多而调控
8、心肌细胞收缩性。NOS1 源性 NO 可通过巯基-亚硝基化直接激活肌质网钙通道蛋白 (Ry R) 并增加 SR 的钙离子释放, 或间接地通过调节 PKA、蛋白磷酸酶 (PP) 活性介导的受磷蛋白的磷酸化, 调控 Ry R 活性以及增强黄嘌呤氧化还原酶 (XOR) 活性和细胞收缩。NOS1 除了生成 NO, 也可以得到一个电子生成NO 的还原产物次硝酸 (HNO) 。研究表明, 外源性 HNO 和 NO 信号具有类似的功能, 及对心肌收缩的影响和相似靶蛋白 (RYR 和 SERCA/PLB) 8。有趣的是, 在心力衰竭中这种现象普遍存在。研究表明, HNO 对心力衰竭的动物模型具有有益作用, 并
9、且可能用于心力衰竭治疗9。2 NOS3 信号NOS3 首次发现于冠状动脉内皮细胞, 被称为 e NOS。然而, 这种酶也存在于多种细胞类型中 (包括心室肌细胞) , 被更名为 NOS3。在心肌细胞, NOS3 结合微囊蛋白-3 (Caveolin-3) 存在于心肌细胞的胞膜小凹 (caveolae) 中。除了能够增加Ca i, NOS3 也可以通过蛋白激酶 (Akt) 激活丝氨酸 1179 位点的磷酸化, 这对终末期心力衰竭的心肌保护起到重要作用10。虽然 NO 是高度可扩散性的气体, 但 NOS 信号具有时间和空间的位点局部性1。由于 NOS1 和 NOS3 存在于心肌细胞的不同部位 (心室
10、肌细胞 caveolae 中和 SR 中) , 它们有各自的信号转导通路、终末靶蛋白以及对心肌功能的影响。与 NOS1 不同的是, NOS3 信号不能调控心肌细胞的收缩, 只能调控 肾上腺素受体 (-AR) 刺激对其引起的收缩。在心肌细胞 caveolae 中, NOS3 定位于 L-型钙通道 (LTCC) 和 -肾上腺素能受体位点处1,11。超氧化物歧化酶 (SOD) 和 NOS3 存在的部位相同, 可以降低 O2含量。含有 O2的缓冲液, 通过 SOD 驱动 NOS3 介导 c GMP/可溶性鸟苷酸环化酶 (s GC) /PKG 信号通路来使多种靶蛋白磷酸化 (即 LTCC) 。与敲除NO
11、S3 基因 (NOS1) 心肌细胞相比, NOS3 心肌细胞给予 -AR 刺激, 其收缩力增加。由于相同的亚细胞定位, NOS3 可以调控 LTCC。总之, 快速抑制野生型心肌细胞 NOS3 或 NOS3, -AR 刺激强度更高, 钙离子内流增加1,11。Sun 等12于 2006 提出, 女性心肌细胞 NOS3 对 LTCC 的作用影响高于男性, 这说明 NOS3信号有性别差异。除了限制 -AR 激发细胞内钙离子内流外, NOS3 信号也可以缩短动作电位时程。在给予 -AR 刺激时, NOS3 小鼠动作电位 (AP) 延长。决定动作电位时程的是各种 K 通道。然而, 在野生型和 NOS3 心
12、肌细胞中的 K 通道变化 (瞬时外向电流 (Ito) 、静息电流 (IKsus) 、内向整流电流 (IK1) ) 无明显变化13。因此, 可以推断, 在 NOS3 心肌细胞中增加钙离子内流可以使Na/Ca 交换 (NCX) 增强, 进而延长动作电位时程。此外, 在 NOS3 心肌细胞中, 增加钙离子内流可以导致 SR 的钙负载。如果 SR 的钙离子超负荷, 可以导致钙离子自发性释放和后除极14。这些情况也存在于 NOS3 小鼠心肌细胞中。因此, NOS3 抑制 LTCC 可以抑制早后除极来预防心律失常的发生。折返性心律失常可以使 AP 持续时间延长。不幸的是, 绝大多数心力衰竭患者的死因是心律
13、失常15。因此, NOS3 功能异常可能参与心力衰竭患者的心律失常。NOS3 参与心律失常的发生外, 还可以抑制心肌肥大。诱导心肌细胞病理性肥厚的主要途径是活化 T 细胞核因子 (NFAT) 钙调神经磷酸酶通路。通过介导 LTCC 钙离子内流激活钙依赖磷酸酶, 使细胞质磷酸化和 NFAT 转移, 进一步导致肥厚性基因的表达。因此, NOS3 和 NO/c GMP/PKG 抑制 LTCC 会减弱钙调磷酸酶的活性, 从而抑制NFAT 易位和心肌肥厚。总之, NOS3 源性 NO 通过限制钙离子内流对心肌有一定的保护作用, 可以预防心律失常的发生和抑制心肌细胞肥厚。3 NOS2 的信号NOS2 首先
14、在有活性的巨噬细胞中被发现, 被称为诱导型一氧化氮合酶, 并为了统一将其更名为 NOS2。在炎症反应中, 心室肌细胞也能诱导 NOS2 的表达。普遍认为 NOS2 参与多种病理条件下的心肌损伤, 如缺血再灌注损伤, 败血症, 衰老, 心肌梗死和心力衰竭。NOS2 信号通过 c GMP 依赖途径和非依赖途径对不同的终末靶蛋白进行多种翻译后修饰 (如磷酸化, S-亚硝基化, 硝化和氧化) , 会导致心肌收缩功能障碍。然而, 也有研究发现 NOS2 表达的积极影响。这种差异可能是由哪种途径被激活 (c GMP 依赖途径或非依赖途径) 和/或终末靶点有关, 这可能取决于心脏中的 ROS 水平。在疾病早
15、期阶段和/或当 NOS2 被表达时, ROS 水平很可能会下降。这将允许 c GMP 依赖途径介导 NOS2 信号表达, 从而达到保护心肌的目的。例如, NOS2 信号可以通过介导 PKG 磷酸化途径减弱 -AR刺激 ICa, 继而限制非生理条件下的钙离子内流。然而, 由于 NOS2 的激活是钙通道/钙调蛋白非依赖性的, 持续性表达 NOS2 会降低 L-精氨酸的浓度, 进而导致 NOS2 的解偶联和 O2的生成16。此外, 通过线粒体、NADPH 氧化酶和 XOR 可增加心力衰竭患者血中的 O2含量。由此产生的高浓度的 ONOO。事实上, 高浓度的 ONOO 会增加 NOS2 的表达, 从而
16、引起心肌收缩功能障碍。因此, NOS2 对心肌收缩功能的影响 (有利或不利) 是时间依赖性的。然而, 研究表明, 用 NOS2 基因敲除 (NOS2) 小鼠制作心力衰竭模型显示, NOS2 的表达对心力衰竭有害。尤其对于压力负荷过大 (小鼠主动脉缩窄模型) 或心肌梗死时, NOS2 小鼠可以更好的保护心肌, 使减少心肌肥大、心室重构、心室扩大、心肌纤维化、收缩功能障碍、细胞凋亡以及降低死亡率17。在心力衰竭中, NOS2 导致心肌收缩功能障碍的机制是通过在 -AR 刺激下减少钙离子瞬变幅度来抑制基础收缩力、减弱正性肌力作用。这通过改变 Ry R 活性和降低 PLB 的磷酸化来实现。4 靶向 NOS 治疗心力衰竭心力衰竭患者中, NO 生物利用度和氧化应激功能减低所导致的 NOS 功能失调是收缩功能障碍、心肌肥厚和心室重构的直接原因。多种治疗方法都尝试去修复心力衰竭患者的 N
