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1、2015-2016年湖南省手足口病 CV-A6型肠道病毒 VP1区基因特征及病毒亚型分析 黄威 陈雨 蔡亮 罗恺炜 张帆 周帅锋 张红 湖南省疾病预防控制中心湖南省微生物分子学重点实验室 摘 要： 目的 了解湖南省 2015-2016年引起手足口病的 CV-A6型肠道病毒病原学特征, 为手足口病科学防控提供依据。方法 对 2015-2016年湖南省手足口病哨点医院和地市级疾控中心上送的其他肠道病毒阳性标本进行 CV-A6核酸检测, 选择有代表性的标本进行 CV-A6 VP1区全长序列扩增和测序。运用 Seqman和 MEGA 5.2软件对获取序列与从 Gen Bank下载的 CV-A6 VP1
2、区全长序列进行遗传进化分析。结果 共对 281份非 EV-A71和非 CV-A16肠道病毒阳性标本进行了 CV-A6核酸检测, 142 份标本检测结果为 CV-A6阳性, 阳性率为 50.53%, 对不同地区和不同年份的有代表性的 69份标本进行 VP1区全长序列测定, 60 份测序成功, 病毒型别均为 CV-A6的 D1亚型。结论 湖南省存在引起手足口病的非 EV-A71和非 CV-A16的 CV-A6肠道病毒感染, 其基因型别为 D1亚型, 与我国其他地区流行的病毒亚型基本一致。关键词： CV-A6; 手足口病; 基因型别; VP1区; 作者简介：黄威 (1966-) , 女, 副主任技师
3、, 主要从事肠道病毒的实验室检测工作。作者简介：张红, E-mail:。基金：湖南省卫计委科研项目 (C2016032) VP1 genetic characteristics and subgenotype of coxsackievirus A6 associated with hand, foot and mouth disease in Hunan Province, 2015-2016HUANG Wei CHEN Yu CAI Liang LUO Kai-wei ZHANG Fan ZHOU Shuai-feng ZHANG Hong Key Laboratory of Microb
4、ial Molecular Biology of Hunan Province, Hunan Provincial Center for Disease Control and Prevention; Abstract： Objective To investigate the pathogenic features of coxsackievirus A6 ( CV-A6) associated with hand, foot and mouth disease ( HFMD) in Hunan Province during 2015-2016 so as to provide a bas
5、is for scientific prevention and control of HFMD. Methods The positive specimens of other enteroviruses sent by HFMD sentinel hospitals and prefecture-level CDCs in Hunan Province during 2015-2016 were collected to perform CV-A6 nucleic acid detection. CV-A6 real-time PCR positive specimens were the
6、n subjected to RT-PCR for full length sequence amplification and sequencing of VP1 region. The phylogenetic analysis was performed to analyze the full-length gene sequences encoding VP1 of CVA6 isolates and sequences downloaded from GenBank by using Seqman and MEGA 5.2 software packages. Results A t
7、otal of 281 non-EV-A71 and non-CV-A16 enterovirus positive specimens were detected by CV-A6 real-time PCR assay. 142 specimens were positive for CV-A6, with the positive rate being 50.53%. 69 specimens from different regions and different years were selected for determining the full length sequence
8、of VP1 region and 60 were successfully determined. It was found that all sequences detected belonged to CV-A6 subtype D cluster 1.Conclusions There are non-EV-A71 and non-CV-A16 enterovirus infections caused by CV-A6 in hand, foot and mouth disease in Hunan Province, and the isolates belong to the D
9、1 subgenotype, which is consistent with the prevalent subtypes in other regions in China.Keyword： coxsackievirus A6; hand; foot and mouth disease; genotype; VP1 region; 目前已知的肠道病毒血清型有 100种以上, 分为 EV-A、EV-B、EV-C 和 EV-D 4类, 其中 EV-A类病毒广泛分布于人类和非人类的灵长类动物中, 有 20种以上血清型。EV-A71 和 CV-A16是引起我国手足口病的主要病原体, 可导致患者脑膜
10、脑炎1。柯萨奇病毒 (coxsackievirus A6, CV-A6) 属于微小核糖核酸病毒科, 病毒核酸为单正链 RNA, 包括 A、B 两组, 其中 A组有 23个血清型, CV-A6可引起人类和其他哺乳类动物多种类型的疾病2。本研究对 2015-2016年发生在湖南省的非 EV-A71和非 CV-A16肠道病毒感染病例进行病原学监测, 发现自 2015年上半年起, 非 EV-A71和非 CV-A16肠道病毒感染患者感染率逐渐升高, CV-A6 逐渐成为优势病原体, 本研究针对性地对部分 CV-A6核酸阳性标本进行序列测定和遗传进化分析。1 材料与方法1.1 标本来源与处理本研究的标本来
11、源于 2015年 1月-2016 年 12月期间湖南省手足口病哨点医院和 14个地市 (州) 疾控中心上送的手足口病患儿粪便、肛拭子、咽拭子。每份标本附带包括性别、年龄、地址、临床症状、生化指标等相关信息的患者个案信息调查表。地市 (州) 疾控中心采集的手足口病患儿标本需先进行肠道病毒、EV-A71和 CV-A16病毒的核酸检测 (real-time PCR 法) , 将结果录入中华人民共和国传染病报告卡, 每月选取 4份手足口病毒阳性标本送至湖南省疾控中心进行复核和病毒分离。所有粪便标本取 0.1 g用 800l PBS (+) 溶液进行稀释, 便悬液在涡轮振荡器上混匀后, 8 000 rp
12、m/min 冷冻离心 5 min, 取200l 上清液进行病毒核酸提取。肛拭子和咽拭子标本直接在涡轮振荡器上混匀后 8 000 rpm/min冷冻离心 5 min, 取 200l 上清液进行病毒核酸提取。1.2 核酸提取使用病毒 DNA/RNA提取试剂盒 (磁珠法, 苏州天隆) 进行标本核酸提取。1.3 核酸检测使用 CV-A6核酸检测试剂盒 (荧光 PCR法, 江苏硕世) 进行 CV-A6病毒的初筛。操作按试剂盒说明书进行。将 CV-A6初筛阳性标本核酸使用 One-Step RT PCR Kit (QIAGEN) 进行逆转录及扩增。引物为 CV-A6 VP1-F:5-TGTGCAAGGAC
13、A-CYGAYGAG-3, CV-A6 VP1-R:5-AGATGYCG-GTTTACCACTCT-3。反应体系为:5Buffer 10l, 10m M DNTP 2l, Inhibitor 0.5l, Enzymer Mix 2l, 20M CV-A6F 1l, 20M CV-A6R 1l, H 2O 28.5l, RNA 5l。反应条件:5030 min9515 min (9430 s4230 s721 min) 30 cycles727 min4。扩增产物使用 QIAxcel DNA Screening Kit (QIAGEN) 进行电泳鉴定。1.4 序列分析对 PCR产物进行纯化及序列
14、测定, 使用 Seqman软件 (Lasergene 7.0) 对测序结果进行拼接与剪切, 获得的最终序列通过 BLAST进行序列比对 (http:/:808/Blast.cgi) 。选取法国、西班牙、台湾、日本等不同国家和我国天津、广东、山东等地区具有代表性的序列与湖南省 2015-2016年的 VP1区序列进行进化分析, 使用 Mega 5.2软件, 选择邻接法 (neighbour-joining method) 构建进化树。VP1 全长序列提交Genebank。2 结果2.1 非 EV-A71和非 CV-A16肠道病毒检出情况2015年 1月-2016 年 12月湖南全省手足口病实验室
15、共检出手足口病阳性标本10 938份, 其中非 EV-A71和非 CV-A16肠道病毒阳性率占全部阳性标本的55.26% (6 044/10 938) , EV-A71阳性标本占 27.30% (2 986/10 938) , CV-A16阳性标本占 17.44% (1 908/10 938) 。2.2 CV-A6核酸检测及病毒分离2015-2016年共对 281份非 EV-A71和非 CV-A16肠道病毒阳性标本进行了 CV-A6核酸检测, 142 份标本检测结果为 CV-A6阳性, 阳性率为 50.53%。其中 2015年 CV-A6阳性率分别为 51.03% (74/145) 和 50.
16、00% (68/136) 。CV-A6 的检出率两年差异无统计学意义 (=0.03, P=0.86) 。以月份为时间进行统计, CV-A6的阳性检出率在 2016年的 3月和 9月均达到 100%, 在 2015年的 4月和2016年的 6月达到最低。见图 1。图 1 2015年 1月-2016 年 12月 CV-A6在湖南省其他肠道病毒阳性标本中的阳性率 下载原图2.3 CV-A6 VP1区序列分析对 2015-2016年湖南省不同地区和不同年份的有代表性的 69份标本使用 VP1区序列专用扩增引物进行 VP1区全长序列测定, 60 份测序成功, CV-A6 获得 PCR产物长度为 1 022 bp, 经 Seqman序列分析软件拼接后, 长度为 915bp。序列株全部为 D基因型, VP1 区核苷酸同源性为 93.10%100%, 与 1949年的 CV-A6
