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1、基于 CDDP 标记铁皮石斛抗性种质筛选与多样性研究 吴永辉 张君毅 司灿 林清郁 华侨大学生物工程与技术系 摘 要： 目的 利用 CDDP 标记技术对 43 份铁皮石斛 Dendrobium officinale 野生和栽培种质进行初步抗性筛选和遗传多样性分析, 为铁皮石斛产业以及优良品种筛选保护提供理论基础。方法 从 21 条 CDDP 引物中筛选出产物清晰、多态性好的引物对供试材料基因组 DNA 进行扩增。结果 16 条引物共扩增出了 151 条带, 其中多态性条带 144 条, 多态性比率 95.7%, 表明供试材料具有丰富的遗传多样性。种群遗传多样性结果表明, 3 个种群多态性位点比
2、例 (PPL) 为65.56%82.12%, 种群间基因分化系数 (Gst) 为 0.110 2, 基因流 (Nm) 为4.035 4, 说明人为选择亦可能促进铁皮石斛的遗传多样性。结论 铁皮石斛人工栽培种具有丰富的遗传多样性, 同时统计结果分析表明, 43 份材料中可以初步筛选出 8 份具有潜在优良抗性的植株。关键词： 铁皮石斛; CDDP 标记; 遗传多样性分析; 抗性筛选; 多态性位点比例; 作者简介：吴永辉 (1991) , 男, 在读硕士, 研究方向为药用植物资源开发与利用。Tel:13290781591E-mail:作者简介：张君毅, 副教授, 硕士生导师, 主要研究方向为药用资源
3、开发与利用。Tel:18759287390E-mail:收稿日期：2017-06-28基金：福建省引导性项目:铁皮石斛良种选育与关键栽培新技术研究 (2015N0028) Screening and diversity of resistance germplasm of Dendrobium officinale by CDDP markersWU Yong-hui ZHANG Jun-yi SI Can LIN Qing-yu Department of Bioengineering & Biotechnology, Huaqiao University; Abstract： Object
4、ive Conserved DNA-Derived Polymorphism (CDDP) markers were used in the study of the genetic diversity of 43 Dendrobium officinale and preliminary resistance screening, in order to provide a theoretical basis for the screening of D. officinale and the selection of fine varieties. Methods A total of 2
5、1 CDDP primers were used to amplify the genomic DNA of the test material with clear and polymorphic primers. Results Sixteen primers generated 151 bands, of which 144 (95.7%) were polymorphic. The results of data analysis on three population showed that the percentage of polymorphic locus (PPL) were
6、 between 65.56% and 82.12%, coefficient of genetic differentiation among natural populations (Gst) was 0.110 2, and the total gene flow (Nm) was 4.035 4. Indicating that anthropogenic factors may also promote the genetic diversity of D. officinale. Conclusion The genetic diversity of D. officinale w
7、as rich, and the results showed that there were eight plants with potentially good resistance among 43 materials.Keyword： Dendrobium officinale Kimura et Migo; CDDP marker; genetic diversity analysis; resistance screening; PPL ; Received： 2017-06-28铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo 为兰科石斛属植物,
8、 又名黑节草、云南铁皮, 以茎入药。生于海拔达 1 600 m 的山地半阴湿的岩石上1。中国药典2015 年版收载其味甘, 微寒, 具有益胃生津、滋阴清热功效。用于热病津伤、阴虚火旺、骨蒸劳热、目暗不明、筋骨痿软等2。现代研究表明, 铁皮石斛中含有石斛多糖、生物碱、氨基酸以及多种微量元素3, 具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、调血脂、改善记忆、抗疲劳等功效4-6。近年来, 因其巨大药用价值和经济价值, 过度采挖加上自然条件下铁皮石斛种子与真菌共生才能萌发, 导致野生资源濒临灭绝7。而人工栽培量逐年增加, 截止 2015 年全国种植面积已突破 60 公顷。但是以保护地栽培为主, 仿野生栽培受
9、到较大限制, 主要原因是铁皮石斛对生长环境要求苛刻, 因此选育抗逆性强的优良品种十分必要。利用分子标记技术辅助选育良种是育种工作中一种常用手段, 但现阶段铁皮石斛仍停留在随机分子标记上, 不能满足抗性育种需求8-9。CDDP (conserved DNA-derived polymorphism) 分子标记是 Collard 和Mackill 2009 年开发的一种目标分子标记技术10。它操作简单, 基于单引物扩增, 针对植物功能基因或基因家族中保守氨基酸序列设计引物, 产生偏向候选功能标记, 并且可以在不同物种间通用, PCR 产物用琼脂糖凝胶即可实现分离, 多态性好, 成本低。与随机分子标
10、记相比, CDDP 标记能有效产生和目标性状连锁的功能性分子标记, 在分子标记辅助育种和遗传多样性分析中有重要的应用价值11。本实验利用 CDDP 标记, 采用 Collard 和 Mackil 针对转录因子WRKY12、生物与非生物因素胁迫应答相关基因 MYB13和在逆境胁迫中起调控作用 ERF 转录因子14等设计的 21 条引物, 建立铁皮石斛 CDDP 标记技术体系, 对来源于野生和栽培的种质资源进行抗性筛选, 并研究分析其遗传多样性和亲缘关系, 以期为铁皮石斛抗性育种提供参考依据。1 材料与方法1.1 材料材料为采集于福建泰宁和邵武的 28 份铁皮石斛栽培种质 (编号 128) 及 1
11、5 份 (编号 2943) 来自泰宁崖壁的野生种质, 经华侨大学张君毅副教授鉴定为铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo。1.2 总 DNA 提取参考 CTAB 法15提取基因组 DNA, 做相应改进。取 0.3 g 叶片, 加少许聚乙烯吡咯烷酮, 液氮研磨至粉末后转移至 2 m L 离心管;加 800L 4预冷 CTAB 缓冲液及 30L-巯基乙醇, 震荡混匀后冰浴 20 min;4下 12 000 r/min 离心5 min, 弃上清;加等体积 65预热 3CTAB 缓冲液和 30L-巯基乙醇, 颠倒混匀, 65水浴 1 h, 并不时轻微震荡;加
12、 500L 氯仿-异戊醇 (241) , 颠倒混匀 5 min, 4、12 000 r/min 离心 10 min, 转移上清液至新离心管, 此步重复 3 次;加 0.1 倍体积 3mol/L Na Ac 和 2 倍体积预冷无水乙醇, -20静置30 min;4、12 000 r/min 离心 15 min;70%乙醇清洗 DNA 沉淀 2 次, 室温干燥30 min, 加 50L TE 溶解 DNA;1%琼脂糖凝胶检测 DNA 完整性;-20保存。1.3 CDDP-PCR 反应体系建立随机选取 3 份样品 DNA, 对反应体系设计 5 因素 (模板、引物、聚合酶、d NTPs、Mg) 4 水
13、平 (表 1) , 并进行 L16 (4) 正交试验 (表 2) , 然后进行梯度退火及单因素优化实验, 最后进行体系验证, 引物为 5-TGGCGSAAGTACGGCCAG-3, 由 Invitrogen 公司合成。PCR 程序为 94预变性5min, 94变性 30 s, 55.7退火 30 s, 72延伸 1.5 min, 35 个循环, 72延伸 10 min, 然后 4保存。表 1 CDDP-PCR 反应体系因素水平 Table 1 CDDP-PCR factors-levels 下载原表 表 2 CDDP-PCR 正交试验设计 Table 2 CDDP-PCR orthogonal
14、 design 下载原表 1.4 产物检测扩增产物用 TBE 配制 1%琼脂糖凝胶 (含 0.05%Gold View) 进行电泳分离, 电压120 V, 凝胶成像系统拍照记录。1.5 数据处理同一引物扩增的所有模板, 同一位置有条带的认定为具有同源性, 在同一迁移位置, 有条带记“1”, 没有记“0”, 在 Excel 中建立数据矩阵。用 Popgene 32 软件进行遗传参数分析, 分别计算多态位点百分率 (PPL) 、观测等位基因数 (N a) 、有效等位基因数 (N e) 、Neis 基因多样性指数 (H) 、Shannons信息指数 (I) 、群体总遗传多样性 (H t) 、群内基因
15、多样性 (H s) 、居群间遗传分化系数 (G st) 和居群间基因流 (N m) 等, 用 NTSYS2.1 软件, 类平均法 (UPGMA) 进行聚类分析和主坐标分析16。1.6 抗性种质筛选对引物类型中 WRKY 类、MYB 类和 ERF 类扩增条带进行统计, 并分别计算出各类型条带数平均值, 大于平均值的个体则认为具有潜在优良抗性, 最后利用在线工具 (http:/ 绘制韦恩图, 找出上述 3 类引物共同筛选出的潜在优良抗性种质。2 结果与分析2.1 CDDP 反应体系建立及引物筛选不同因素水平组合的 CDDP-PCR 体系扩增结果各不相同, 从图 1 可以看出3、4、7、9、10 号
16、组合均有相对清晰条带, 其中 7、10 号较理想, 2 号组合没有条带, 5、6 号条带较弱, 8、1116 号条带清晰度稍弱。图 1 CDDP 正交设计体系的扩增结果 Fig.1 CDDP system with orthogonal design 下载原图综合梯度退火实验及单因素优化实验 (部分实验见图 2、3) , 最终确定 20L体系, 其中, DNA 模板 30 ng、引物 0.5mol/L、聚合酶 1.5 U、d NTPs0.2 mmol/L、Mg2.75 mmol/L, 并进行体系验证 (图 4) 。应用优化体系, 以样品DNA 为模板, 对 Collard 和 Mackill12发表的 21
