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1、贝类包纳米虫病焦磷酸测序检测方法的建立与应用 王彩霞 吴绍强 林祥梅 王素华 冯春燕 徐赓 中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所 浙江省温州出入境检验检疫局 山东省沂南县畜牧兽医局 摘 要： 以焦磷酸测序技术为检测平台, 在研究包纳米虫基因特性的基础上, 选择包纳米虫 (Bonamiaspp.) DNA 序列的保守区域, 利用焦磷酸测序软件设计专用引物。以 OIE 推荐的 PCR 方法构建的阳性质粒作为模板, 建立了包纳米虫的 PCR-焦磷酸测序检测方法, 确定测得序列为包纳米虫序列, 经酶切位点分析可鉴别感染种类。以建立的包纳米虫 PCR-焦磷酸测序方法对进口牡蛎 (Ostrea gigas
2、 thunberg) 样品进行检测, 同时以 OIE 推荐的 PCR-RFLP 方法进行对照检测, 检测结果表明, 本研究建立的 PCR-焦磷酸测序检测方法可以在基因序列水平上准确鉴定样品是否为包纳米虫感染以及感染种类, 检测结果与 OIE 推荐方法的检测结果一致。研究结果表明, 本研究建立的检测方法可应用于口岸包纳米虫感染情况的检测鉴定。关键词： 牡蛎; 包纳米虫; 聚合酶链式反应; 焦磷酸测序; 检测; 鉴定; 作者简介：王彩霞 (1982-) , 女, 助理研究员。E-mail:作者简介：吴绍强 E-mail:收稿日期：2016-12-11基金：国家科技支撑计划项目 (2013BAD12
3、B02) 资助Development and Application of Pyrosequencing Method Detecting Bonamia spp. Caused Disease of BivalvesWANG Cai-Xia WU Shao-Qiang LIN Xiang-Mei WANG Su-Hua FENG Chun-Yan XU Geng The Institute of Animal Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine; Wenzhou Entry-Exit Inspection and
4、Quarantine Bureau; Bureau of Animal Husbandry and Veterinary in Yinan County of Shandong Province; Abstract： One pair of specific primers were designed and used to pyrosequencing the conserved region of Bonamia DNA with PyroMark software basing on pyrosequencing platform and Bonamiagene characterist
5、ics.PCR-pyrosequencing method was established with the recombinant plasmid of Bonamia spp.constructed with OIE PCR method as the template.The obtained sequence can be identified as the sequence of Bonamiaspp.through Blast analysis, and enzyme digestion site analysis identified the specie as Bonamias
6、pp.The imported oysters were detected with the newly developed method and PCR-RFLP as well as was recommended by OIE.The result showed that the developed PCR-pyrosequencing method can be used to correctly identifying Bonamiaspp.infection and species.The detection results were consistent with that yi
7、elded with OIE method.Therefore, this method can be applied to the detection and identification of Bonamiaspp.infection in port.Keyword： Oyster; Bonamia spp.; PCR; pyrosequencing; detection; identification; Received： 2016-12-11牡蛎包纳米虫病是由牡蛎包纳米虫 (Bonamia ostreae) 、杀蛎包纳米虫 (B.exitiosa) 等在牡蛎 (Oyster) 血细胞内
8、寄生或者游离在结缔组织、鳃、内脏或套膜上皮中而引起贝类的一种严重的寄生虫病。现发现的包纳米虫包括 5个种, 除主要寄生在欧洲牡蛎体内的牡蛎包纳米虫 (B.ostreae) 、杀蛎包纳米虫 (B.exitiosa) 1外, 还有寄生在悉尼牡蛎体内的鲁道夫包纳米虫 (B.roughleyi) 2、美国牡蛎体内的成孢包纳米虫 (B.perspora) 3和澳大利亚牡蛎体内的包纳米虫未定种 (Bonamiasp.) 4。目前, 除牡蛎包纳米虫、杀蛎包纳米虫为世界动物卫生组织 (Office International Des Epizooties, OIE) 规定的检疫性疫病外, 其它 3 种均为非检
9、疫性寄生虫5。1980 年, Pichot 等6指出, 牡蛎包纳米虫是造成欧洲牡蛎大量死亡的重要原因之一, 此后, 人们对牡蛎包纳米虫进一步研究, 发现牡蛎包纳米虫是一种软体动物血液原虫。1987 年爱尔兰科克港 (Cork) 发生牡蛎包纳米虫病, 死亡率达90%;1989 年, 爱尔兰戈尔韦海峡 (Galway) 的牡蛎感染牡蛎包纳米虫, 死亡率达 70%80%7。1995 年, 牡蛎包纳米虫与折光马尔太虫 (Marteilia refringens) 同时爆发, 使法国贝类产品从 1970 年的 20 000t 下降至 1 800t8。阿根廷圣安东尼奥 (San Andonio) 海湾自
10、1995 年初次报道以来, 1996 年导致 33%的牡蛎死亡, 1997 年的牡蛎累计死亡率高达 95%, 使得牡蛎养殖业遭到重创9, 近十几年来, 牡蛎包纳米虫病的流行趋于缓和, 虽未出现重大的流行, 但在美国、英国、爱尔兰、加拿大等地时有发生, 流行率从百分之零点几到百分之三、四十不等。2004 年英国大不列颠牡蛎养殖场牡蛎大量死亡10, 经证实, 导致此次牡蛎大量死亡的原因正是牡蛎包纳米虫, 牡蛎包纳米虫病已成为对欧洲和美国牡蛎养殖业影响重大的主要疾病之一。2008 年 3 月 13日, 英国向 OIE 报告, 本国自 2007 年 11 月以来, 在北肯特 (North Kent)
11、海湾发生包纳米虫感染, 受感染贝类数量达 500 万, 其中发病 10 万11。2009年, 挪威的东阿格德尔郡 (AUST-AGDER) 在野生牡蛎中发生包纳米虫病, 这是挪威首次发生包纳米虫病, 感染来源尚不清楚。2016 年澳大利亚首次发生杀蛎包纳米虫病, 这是 OIE 关于该病最近一次的疫情报道。包纳米虫能直接在牡蛎间通过呼吸、食物而传播, 但其生活史尚不清晰, 是否存在中间宿主或携带者尚未研究清楚。包纳米虫的检测方法主要包括一些形态学、免疫学及分子生物学检测方法。形态学检测方法能直接观察到虫体, 操作相对比较简单, 检测费用低, 但检出率较低, 主要有虫体浓缩法、病理切片技术、组织印
12、记法、组织细胞学等;而分子生物学方法敏感性、特异性较高, 能检测到牡蛎包纳米虫感染的潜伏期, 目前主要有原位杂交法、PCR 技术、实时荧光定量 PCR 技术12以及鉴别物种类别的 PCR-限制性片段长度多态性分析方法 (PCR-RFLP) 技术。但是 PCR 技术以及实时荧光 PCR 无法获得基因的序列信息, 不能从基因序列水平进行鉴定, 且容易造成假阳性、假阴性结果的出现, DNA测序技术虽然能解决基因序列水平上的检测问题, 但是存在取样、送样、结果反馈等手续繁琐以及检测速度慢、成本高的缺点, 不利于大规模样本的快速检测。相关报道指出, 在实际工作中, 如果引物对选择得好, 很短的一段保守/
13、特异序列的测定就可满足对病原分子诊断的需要13。焦磷酸测序技术是 1987 年发展起来的一种能够进行定量序列测定的新型 DNA 测序技术14, 具有高通量、快速、敏感等特点, 该技术利于大批量样本的检测15。因此, 本研究拟利用焦磷酸测序技术建立包纳米虫基因序列水平上的检测方法, 并应用于进口牡蛎样品的包纳米虫检测鉴定。1 材料与方法1.1 材料样品 2016 年 3 月, 温州出入境检验检疫局从荷兰和法国进口的牡蛎样品。阳性对照牡蛎包纳米虫 (Bonamia Ostreae) DNA 由法国软体动物疾病参考实验室的 Isabelle Arzul 教授惠赠。阴性对照实验室保存的采自中国东部沿海
14、的牡蛎, 已经 OIE 方法16检测确认无包纳米虫感染。1.2 方法1.2.1 包纳米虫焦磷酸测序方法的建立1.2.1. 1 阳性克隆质粒的构建以法国软体动物疾病参考实验室 Isabelle Arzul 教授惠赠的牡蛎包纳米虫 DNA为模板, 采用 OIE 发表的根据牡蛎包纳米虫核糖体 DNA (rDNA) 设计的特异性引物 Bo:5-CATTTA-ATTGGTCGGGCCGC-3, Boas:5-CTGATCGTC TTCGATCCCCC-3, 按照 OIE 推荐的反应条件进行聚合酶链反应, 预期扩增片段长度为 300bp16。PCR 产物电泳后, 采用 Agarose Gel DNA Pu
15、rification Kit (OMEGA) 切胶回收目的条带, 并克隆到 pGEM-T 载体, 转化至大肠杆菌E.coli JM109 感受态细胞。经蓝白斑筛选、PCR 鉴定获得含有目的基因片段的重组质粒并纯化, 测浓度后-20保存备用。1.2.1. 2 引物设计根据 GenBank 中包纳米虫基因组 DNA 序列 AF262995.1 的保守区域片段, 利用焦磷酸测序检测系统的自带软件设计引物。上游引物 BoF:5-CGCTGGTCCTGATCCTTTACT-3;下游引物 BoR:5-Biotin-TACTAGCACCCCCAATTGTTTC-3, 产物长度为 168 bp, 测序引物 B
16、oS:5-GAATGCATTAG-CATGG-3。引物由上海英维捷基生物技术有限公司合成。灭菌水稀释引物为 10mol/L, 分装, -20保存备用。1.2.1. 3 焦磷酸测序PCR 扩增以构建的包纳米虫阳性质粒为模板, 以焦磷酸测序引物 (BoF/BoR) 进行 PCR 扩增。25L 的 PCR 反应体系:10PCR Buffer 2.5L, 2.5 mmol/L dNTP 2L, 10mol/L BoF 1L, 10mol/L BoR 1L, 5U/L rTaq 0.5L, 质粒DNA1L, ddH 2O 补充至 25L。PCR 反应条件为:95预变性 5min, 95变性30s, 58退火 30s, 72延伸 30s, 扩增 50 个循环;最后 72补充延伸 5min。扩增完毕取 5L PCR 产物以 2%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.2
