普通光学显微镜的结构与使用方法

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1、实验一 普通光学显微镜的结构与使用方法【 目的要求 】1、熟悉普通光学显微镜的主要构造及其性能。2、掌握低倍镜及高倍镜的使用方法。3、初步掌握油镜的使用方法。4、了解光学显微镜的维护方法。【 实验原理 】光学显微镜(light microscope)是生物科学和医学研究领域常用的仪器，它在细胞生物学、组织学、病理学、微生物学及其他有关学科的教学研究工作中有着极为广泛的用途，是研究人体及其他生物机体组织和细胞结构强有力的工具。光学显微镜简称光镜，是利用光线照明使微小物体形成放大影像的仪器。目前使用的光镜种类繁多，外形和结构差别较大，有些类型的光镜有其特殊的用途，如暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显

2、微镜，倒置显微镜等，但其基本的构造和工作原理是相似的。一台普通光镜主要由机械系统和光学系统两部分构成，而光学系统则主要包括光源、反光镜、聚光器、物镜和目镜等部件。光镜是如何使微小物体放大的呢？物镜和目镜的结构虽然比较复杂，但它们的作用都是相当于一个凸透镜，由于被检标本是放在物镜下方的 12 倍焦距之间的，上方形成一倒立的放大实相，该实相正好位于目镜的下焦点（焦平面）之内，目镜进一步将它放大成一个虚像，通过调焦可使虚像落在眼睛的明视距离处，在视网膜上形成一个直立的实像。显微镜中被放大的倒立虚像与视网膜上直立的实像是相吻合的，该虚像看起来好像在离眼睛 25cm 处。分辨力是光镜的主要性能指示。所谓

3、分辨力(resolving power)也称为辨率或分辨本领，是指显微镜或人眼在 25cm 的明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，即分辨出标本上相互接近的两点间的最小距离的能力。据测定，人眼的分辨力约为 100 m。显微镜的分辨力由物镜的分辨力决定，物镜的分辨力就是显微镜的分辨力，而目镜与显微镜的分辨力无关。光镜的分辨力（R） （R 值越小，分辨率越高）可以下式计算：这里 n 为聚光镜与物镜之间介质的折射率（空气为 1、油为 1.5） ； 为标本对物镜镜口张角的半角，sin 的最大值为 1； 为照明光源的波长（白光约为 0.5m） 。放大率或放大倍数是光镜性能的另一重要参数

4、，一台显微镜的总放大倍数等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。【 器材与试剂 】普通光学显微镜、擦镜纸、香柏油或液体石蜡（石蜡油） 、羊毛交叉装片、英文字母或数字的装片、清洁剂（乙醚 7 份 + 无水乙醇 3 份） 、二甲苯。【 内容与方法 】一、光学显微镜的基本构造及功能（一）机械部分1、镜筒：为安装在光镜最上方或镜臂前方的圆筒状结构，其上端装有目镜，下端与物镜转换器相连。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式或双筒式两类。单筒光镜又分为直立式和倾斜式两种。而双筒式光镜的镜筒均为倾斜的。镜筒直立式光镜的目镜与物镜的中心线互成 45 度角，在其镜筒中装有能使光线折转 45 度的棱镜。2、物镜转换器：

5、又称物镜转换盘。是安装在镜筒下方的一圆盘状构造，可以按顺时针或反时针方向自由旋转。其上均匀分布有 34 个圆孔，用以装载不同放大倍数的物镜。转动物镜转换盘可使不同的物镜到达工作位置（即与光路合轴） 。使用时注意凭手感使所需物镜准确到位。3、镜臂：为支持镜筒和镜台的弯曲状构造，是取用显微镜时握拿的部位。镜筒直立式光镜在镜臂与其下方的镜柱之间有一倾斜关节，可使镜筒向后倾斜一定角度以方便观察，但使用时倾斜角度不应超过 45 度，否则显微镜则由于重心偏移容易翻倒。在使用临时装片时，千万不要倾斜镜臂，以免液体或染液流出，污染显微镜。4、调焦器：也称调焦螺旋，为调节焦距的装置，位于镜臂的上端（镜筒直立式光

6、镜）或下端（镜筒倾斜式光镜） ，分粗调螺旋（大螺旋）和细调螺旋（小螺旋）两种。粗调螺旋可使镜筒或载物台以较快速度或较大幅度的升降，能迅速调节好焦距使物像呈现在视野中，适于低倍镜观察时的调焦。而细调螺旋只能使镜筒或载物台缓慢或较小幅度的升降（升或降的距离不易被肉眼观察到） ，适用于高倍镜和油镜的聚焦或观察标本的不同层次，一般在粗调螺旋调焦的基础上再使用细调焦螺旋，精细调节焦距。有些类型的光镜，粗调螺旋和细调螺旋重合在一起，安装在镜柱的两侧。左右侧粗调螺旋的内侧有一窄环，称为粗调松紧调节轮，其功能是调节粗调螺旋的松紧度（向外转偏松，向内转偏紧） 。另外，在左侧粗调螺旋的内侧有一粗调限位环凸柄，当用

7、粗调螺旋调准焦距后向上推紧该柄，可使粗调螺旋限位，此时镜台不能继续上升但细调旋仍可调节。5、载物台：也称镜台，是位于物镜转换器下方的方形平台，是放置被观察的玻片标本的地方。平台的中央有一圆孔，称为通光孔，来自下方光线经此孔照射到标本上。在载物台上通常装有标本移动器（也称标本推进器） ，移动器上安装的弹簧夹可用于固定玻片标本，另外，转动与移动器相连的两个螺旋可使玻片标本前后左右地移动，这样寻找物像时较为方便。在标本移动器上一般还附有纵横游标尺，可以计算标本移动的距离和确定标本的位置。游标尺一般由主标尺（A）和副标尺（B）组成。副标尺的分度为主标尺的910。使用时先看到标尺的 0 点位置，再看主副

8、标尺刻度线的重合点即可读出准确的数值图 1-2 游标尺的使用方法示意图6、镜柱：为镜臂与镜座相连的短柱。7、镜座：位于显微镜最底部的构造，为整个显微镜的基座，用于支持和稳定镜体。有的显微镜在镜座内装有照明光源等构造。（二）光学系统部分光镜的光学系统主要包括物镜、目镜和照明装置（反光镜、聚光器和光圈等） 。1、目镜：又称接目镜，安装在镜筒的上端，起着将物镜所放大的物像进一步放大的作用。每个目镜一般由两个透镜组成，在上下两透镜（即接目透镜和会聚透镜）之间安装有能决定视野大小的金属光阑视场光阑，此光阑的位置即是物镜所放大实像的位置，故可将一小段头发粘附在光阑上作为指针，用以指示视野中的某一部分供他人

9、观察。另外，还可在光阑的上面安装目镜测微尺。每台显微镜通常配置 23 个不同放大倍率的目镜，常见的有 5、10和 15（表示放大倍数）的目镜，可根据不同的需要选择使用，最常使用的是 10目镜。2、物镜：也称接物镜，安装在物镜转换器上。每台光镜一般有 34 之个不同放大倍率的物镜，每个物镜由数片凸透镜和凹透镜组合而成，是显微镜最主要的光学部件，决定着光镜分辨力的高低。常用物镜的放大倍数有 10、40和 100等几种。一般将 8或 10的物镜称为低倍镜（而将 5以下的叫做放大镜） ；将 40或 45的称为高倍镜；将 90或 100的称为油镜（这种镜头在使用时需浸在镜油中） 。在每个物镜上通常都刻有

10、能反映其主要性能的参数，主要有放大倍数和数值孔径（如 10025、400.65 和 1001.25） ，该物镜所要求的镜筒长度和标本上的盖玻片厚度（1600.17，单位 mm）等，另外，在油镜上还常标有“油”或“Oil”的字样。油镜在使用时需要用香柏油或石蜡油作为介质，这是因为油镜的透镜和镜孔较小，而光线要通过载玻片和空气才能进入物镜中，玻璃与空气的折光率不同，使部分光线产生折射而损失掉，导致进入物镜的光线减少，而使视野暗淡，物像不清。在玻片标本和油镜之间填充折射率与玻璃近似的香柏油或石蜡油时（玻璃、香柏油和石蜡油的折射率分别为 1.52、1.51、1.46，空气为 1） ，可减少光线的折射，

11、增加视野亮度，提高分辨率。物镜分辨力的大小取决于物镜的数值孔径（numerial aperture,N.A.） ，N.A.又称为镜口率，其数值越大，则表示分辨力越高。图 1-3 物镜的性能参数及工作距离C 线为盖玻片的的上表面，10物镜的工作距离为 7.63mm；40 物镜的工作距离为 0.198mm；10/0.25、40/0.65、100/1.25 表示镜头的放大倍数和数字孔径。160/0.17 表示显微镜的机械镜筒长度（标本至目镜的距离）和盖玻片的厚度。即镜筒长度为 160mm，盖玻片厚度为 0.17mm。不同的物镜有不同的工作距离。所谓工作距离是指显微镜处于工作状态（焦距调好、物像清晰）

12、时，物镜最下端与盖玻片上表面之间的距离。物镜的放大倍数与其工作距离成反比。当低倍镜被调节到工作距离后，可直接转换高倍镜或油镜，只需要用细调螺旋稍加调节焦距便可见到清晰的物像，这种情况称为同高调焦。不同放大倍数的物镜也可从外形上加以区别，一般来说，物镜的长度与放大倍数成正比，低倍镜最短，油镜最长，而高倍镜的长度介于两者之间。表 1-1 标准物镜的性质放大倍数 数字孔径 工作距离（mm）1020400.200.500.656.52.00.6100 1.25 0.23、聚光器：位于载物台的通光孔的下方，由聚光镜和光圈构成，其主要功能是光线集中到所要观察的标本上。聚光镜由 23 个透镜组合而成，其作用

13、相当于一个凸透镜，可将光线汇集成束。在聚光器的左下方有一调节螺旋可使其上升或下降，从而调节光线的强弱，升高聚光器可使光线增强，反之则光线变弱。光圈也称为彩虹阑或孔径光阑，位于聚光器的下端，是一种能控制进入聚光器的光束大小的可变光阑。它由十几张金属薄片组合排列而成，其外侧有一小柄，可使光圈的孔径开大或缩小，以调节光线的强弱。在光圈的下方常装有滤光片框，可放置不同颜色的滤光片。4、反光镜：位于聚光镜的下方，可向各方向转动，能将来自不同方向的光线反射到聚光器中。反光镜有两个面，一面为平面镜，另一面为凹面镜，凹面镜有聚光作用，适于较弱光和散射光下使用，光线较强时则选用平面镜（现在有些新型的光学显微镜都

14、有自带光源，而没有反光镜；有的二者都配置） 。二、光学显微镜的使用方法（）准备将显微镜小心地从镜箱中取出（移动显微镜时应以右手握住镜壁，左手托住镜座） ，放置在实验台的偏左侧，以镜座的后端离实验台边缘约 610cm 为宜。首先检查显微镜的各个部件是否完整和正常。如果是镜筒直立式光镜，可使镜筒倾斜一定角度（一般不应超过 45 度）以方便观察（观察临时装片时禁止倾斜镜臂） 。（二）低倍镜的使用方法1、对光：打开实验台上的工作灯（如果是自带光源显微镜，这时应该打开显微镜上的电源开关） ，转动粗调螺旋，使镜筒略升高（或使载物台下降） ，调节物镜转换器，使低倍镜转到工作状态（即对准通光孔） ，当镜头完全

15、到位时，可听到轻微的扣碰声。打开光圈并使聚光器上升到适当位置（以聚光镜上端透镜平面稍低于载物台平面的高度为宜） 。然后用左眼向着目镜内观察（注意两眼应同时睁开） ，同时调节反光镜的方向（自带光源显微镜，调节亮度旋钮） ，使视野内的光线均匀、亮度适中。2、放置玻片标本：将玻片标本放置到载物台上用标本移动器上的弹簧夹固定好（注意：使有盖玻片或有标本的一面朝上） ，然后转动标本移动器的螺旋，使需要观察的标本部位对准通光孔的中央。3、调节焦距：用眼睛从侧面注视低倍镜，同时用粗调螺旋使镜头下降（或载物台上升） ，直至低倍镜头距玻片标本的距离小于 0.6cm（注意操作时必须从侧面注视镜头与玻片的距离，以避

16、免镜头碰破玻片） 。然后用左眼在目镜上观察，同时用左手慢慢转动粗调螺旋使镜筒上升（或使载物台下降）直至视野中出现物像为止，再转动细调螺旋，使视野中的物像最清晰。如果需要观察的物像不在视野中央，甚至不在视野内，可用标本移动器前后、左右移动标本的位置，使物像进入视野并移至中央。在调焦时如果镜头与玻片标本的距离已超过了 1cm 还未见到物像时，应严格按上述步骤重新操作。（三）高倍镜的使用方法1、在使用高倍镜观察标本前，应先用低倍镜寻找到需观察的物像，并将其移至视野中央，同时调准焦距，使被观察的物像最清晰。2、转动物镜转换器，直接使高倍镜转到工作状态（对准通光孔） ，此时，视野中一般可见到不太清晰的物像，只需调节细调焦螺旋,一般都可使物像清晰。请注意：（1）在从低倍镜准焦的状态下直接转换到高倍镜时，有时会发生高倍物镜碰擦玻片而不能转换到位的情况（这种情况，主要是高倍镜、低倍镜不配套，即不是同一型号的显微镜上的镜头） ，此时不能硬转，应检查玻片是否放反、低倍镜