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1、引物的具体设计要求： 1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区 5端的 300-400bp 区域内，可以用 DNAman,Alignment 软件 看看结果。2. 产物不能形成二级结构（自由能小于 58.61KJ/mol） 。3.引物长度一般在 17-25 碱基之间 ,上下游引物不能相差太大。4.G+C 含量在 40%60%之间，45-55最佳。5.碱基要随机分布，尽量均匀。6.引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。7.引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。8.引物 5端可以修饰。9.3端不可修饰，而且要避开 AT,GC rich 的区域，避开 T/C,A/G 连续结构（2
2、-3 个） 。10. 引物 3端要避开密码子的第 3 位。11.引物整体设计自由能分布 5端大于 3端，且 3端自由能最好小于 9KJ/mol。可用 oligo 6 软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度 80-150bp 最好，最长是 300bp.13.引物设计避免 DNA 污染，最好跨外显子接头区。14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于 70或者有 8 个互补碱基同源。15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的 DNA 序列，与需要扩增的目的片段长度相似。16.TM 值在 58-62 度之间。17.引物设计的软件 Primer 5.0 有专门针对荧光的。设计的目的是在
3、两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： 引物长度一般引物长度为 1830 碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm 值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。在引物长度小于 20bp 时：4(G+C)+2(A+T)-5在引物长度大于 20bp 时：62.3+0.41(%G-C)-500/length-5另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化 PCR 反应，使用确保退火温度不低于 54的
4、最短的引物可获得最好的效率和特异性。总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高 4 倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18 个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶 DNA 上形成供 DNA 聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。 GC 含量一般引物序列中 G+C 含量一般为 40%60%，一对引物的 GC 含量和 Tm 值应该协调。若是引物存在严重的 GC 倾向或 AT 倾向则可以在引物 5端加适量的 A、T 或 G、C 尾巴。 退火温度退火温度需要比解链温度低 5，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使 PCR 的特异性增加
5、；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是 DNA 双链结合。一对引物的退火温度相差 46不会影响 PCR 的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在 5575间变化。 避免扩增模板的二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于 58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。 与靶 DNA 的错配当被扩增的靶 DNA 序列较大的时候，一个引物就有可能与靶 DNA 的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用 BLAST 软件进行检测，网址：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
