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1、1动物乳腺生物反应器的原理及进展摘要：动物乳腺生物反应器技术是转基因技术的应用，于上世纪 80年代提出，其目的是利用动物乳腺产生目的蛋白。利用该技术生产的蛋白具有低成本，高活性，易提取纯化的优点。虽然该技术尚处于发展时期，但具有广阔的应用前景和巨大地商业潜力，是许多公司大力发展的对象。关键词：动物乳腺生物反应器、原理、进展、优点2动物乳腺生物反应器（mammary gland reactor）是指利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并能从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。 1生物反应器(bioreactor) 经历了3 个发展阶段：细菌基因工程、细胞基因
2、工程、转基因动物生物反应器。细菌基因工程产物往往不具备生物活性,必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后, 才能成为有效的药物,而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻,成本太高,限制了规模生产。动物生物反应器具有产品质量高,容易提纯的特点，弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。它是在转基因技术体系基础上发展起来的。 7自从上世纪80年代出现以来，已经取得了许多突破，现己成为生物技术研究的热点。并向商业化阶段转变，显示了广阔的应用前景。并且利用转基因动物乳腺生物反应器生产饮用奶，以期望获得既能满足蛋白质需要，又能增加抵抗力的品质全面的奶，为人类服务。 21、动物乳腺生物反应器的原理乳
3、腺生物反应器的原理是应用重组DNA 技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。 1 外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。它是一个专门化的分泌腺体，可以生产出具完全生物活性的药用重组蛋3白质，其纯化简单，生产投资及成本相对较少，而且对环境不具污染性，也被称为“分子农场”。2、动物乳腺生物反应器的主要研究内容2、1 乳腺特异表达载体的构建乳腺特异表达载体就是能够在动物的乳腺
4、部位特异表达携带外源目的基因的DNA片段。目前已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因。 7乳腺特异表达载体的首先要具备乳腺特异的启动子，目前所熟知的乳腺特异启动子有Beta-乳球蛋白基因的启动子，S1 /Beta 酪蛋白启动子( S1 /Beta Casein，CA) ，乳清酸蛋白基因启动子，其中研究最多和效果较佳的是绵羊的BLG、牛的S1CA、山羊的Beta-CA、小鼠的WAP 等基因的启动子如果得用目的基因的DNA序列而不是cDNA,表达效果可能会更好。不翻译的外显子和内含子的掺入可能有利于转基因的
5、表达。52 2 乳腺生物反应器的基因介导方法 91) 微注射法微注射法是指直接将裸露的线形DNA 直接注射到胚胎原核中，使得目的DNA 整合到宿主基因组上。 这种方法基因整合效率低，在家畜中尤其如此，家兔和猪为5% 15%，山羊2%，绵羊1% 5%，而牛不超过0 5%，而且成本高; 基因只能加入，不能剔除或原位修饰; 整合是随机的，由于插人位点的关系，转基因的表达不确定;4随机整合可能破坏重要的内源性DNA 序列或激活细胞的致癌基因; 产生的转基因动物常常是嵌合体，即并非所有细胞都整合有外源基因; 以及不能在胚胎早期确定性别等。2) 细胞转染与核移植利用近年来发展起来的基因打靶技术，可以将目的
6、基因定点整合至细胞染色体上的特定位置，目前基因打靶的位置主要还集中在乳蛋白基因座，因为乳蛋白的敲除对于宿主本身的影响不是很大。 目前反刍动物的干细胞发展很缓慢，利用体细胞打靶在理论上是可行的，但是体细胞基因打靶的效率比干细胞要低2 个数量级。 而且非同源重组的效率特别高，需要提高多种途径提高打靶效率，目前核移植的方法几乎就是整个转基因的关键步骤，也是限制转基因动物生产的“限速步骤”，目前体细胞克隆技术也有很多有待完善的地方，如克隆胎儿怀孕率低、易流产、出生后健康状况不好等，导致克隆技术效率低下，平均不到10%的克隆胚胎会产生一个活的后代。核移植技术的常规化需要在众多方面加以改进，特别是针对围产
7、期胚胎死亡和细胞体外长期培养对克隆胚胎造成的不利影响。 3) 精子载体法该方法实验的重复性很差，且DNA 整合进基因组后，基因重排现象严重。然而，最近有研究显示，通过体外受精或人工授精的方法，目的DNA 与抗精子表面蛋白的抗体结合，能有效进入受精卵中，这个方法目前已经成功地生产出转基因小鼠与猪，外源基因以这种途径进入动物体内整合效率高，没有基因重排现象，能表达且能传5递给子代 这种方法似乎又给精子作为载体的转基因方法带来的曙光。4) 逆转录病毒法将外源基因替换病毒基因组的gag，pol 和env 等基因，通过顺式元件的调控序列和感染成分重组病毒载体，然后注射到第二次减数分裂中期的卵母细胞，体外
8、受精和筛选后，将胚胎移人假孕母体的子宫内，继续发育成转基因动物。 该方法整合稳定，拷贝数和插入位点相对固定，转基因效率高。 然而转录病毒载体容量有限，只能转移小于10kb 片段的DNA，而且基因是随机插入的，由于多处整合而产生嵌合体; 虽然设计时缺失复制功能序列，但复制大量载体所需的辅助病毒基因组也可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，有可能产生辅助病毒株，从而产生生物安全性问题。5) 电穿孔法电穿孔法是在外界高电压短脉冲的作用下改变了细胞膜的结构，使细胞膜产生可逆性电穿孔，使得外源DNA 通过细胞膜进入细胞，然后将经过筛选的转基因细胞用显徽注射法，注入去核的卵母细胞的卵周隙，施加电脉冲使供体
9、核与去核卵母细胞融合，获得转基因重构胚。 再经过电激活或化学激活，使重构胚胎发育，然后在体外或通过中间受体使其发育到囊胚，最后将胚胎移植到同期发情处理的受体中，适于转染多种细胞。6) 脂质体法通过脂质体包埋、介导，将外源基因转染到培养的体细胞，然6后将此细胞与去核卵母细胞融合，融合的重构胚胎经电激活后在体外培养至囊胚，移入受体动物，最终获得转基因个体。脂质体法产生个体的外源基因整合率为100% 采用脂质体方法转染体细胞，相比较而言，脂质体转染的效率要高于电穿孔法转染，且对细胞的损伤较小，但对于有些类型的细胞，脂质体的转染效果要比电穿孔转染差。7) 干细胞介导法利用化学转染或电击法将目的基因导人
10、为分化的胚胎干细胞( ES) 中，目的基因通过同源重组整合到细胞染色体基因组特定位点上，然后将转基因ES 细胞注人同系动物胚胎的囊胚中，发育成携带有目的基因的转基因动物个体。 该方法最大的优点是能在细胞水平进行筛选和确定性别; 能随机整合和同源重组整合; 能加入、剔除或替换某个基因、进行小到一个或几个核苷酸修饰。 其局限性是目前ES 细胞仅在小鼠、鸡和人的早期胚胎中分离出来，其它动物还没有成功建立分离ES 细胞的技术; 并且ES 细胞的培养条件苛刻，不同ES细胞株的生殖系传代能力相差很大，而且ES 细胞介导的转基因需要经过嵌合体这一中间步骤。23转基因动物模型的建立 2表达产物是否有生物活性、
11、对动物生长发育是否有副作用及其表达水平能否达到商业化生产的需求等，是衡量乳腺生物反应器是否成功的重要标准，因此需要动物模型来检测效果。制作转基因动7物模型时要考虑研究周期、可操作性、成功率、成本及风险等诸多因素，跟其他动物相比，小鼠是最理想的动物模型，它成本低、研究周期短、可操作性强，因此大部分研究者将小鼠作为动物实验模型。1987 年，Gordon 等构建了由小鼠WAP 基因启动区驱动的人组织纤溶酶原激活剂( t-PA) 重组表达载体，首建乳腺生物反应器小鼠模型。3、动物乳腺生物反应器的历史及研究进展3国外研究现状自世纪年代末提出动物乳腺生物反应器的设想以来，国外在此方面的研究取得了突破性进
12、展。1987年，首次成功地从转基因小鼠的乳汁中获得了人类组织型溶酶原激活剂，此举开创了新的研究领域，随后各国展开了大量的研究。1990年，美国获得世界上第一头转基因公牛，该公牛可与非转基因母牛生产转基因后代，其的后代母牛乳腺表达了人乳铁蛋白。等于2006年通过精子微注射受精卵获得了整合人重组促红细胞生成素的转基因猪，对代和代母猪的乳样进行分析表明，其氨基酸组成与商业化的重组促红细胞生成素完全相同。美国GTC Biotherapeutics 公司利用山羊乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶( 商品名: ATryn) 已于2006 年获得欧洲药监局批准上市， 2009 年2 月该药获得美国FDA 批
13、准上市，标志着一场生物制药革命的开始。荷兰Genpharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从乳汁中提炼出来的营养奶粉的销售额是50亿美元。 2、483国内研究现状尽管我国在该项技术上取得了较大进展，但仍处于探索研究阶段。我国对动物乳腺生物反应器的研究起步较早，上世纪年代初，施履吉院士就提出了乳腺生物反应器的构想，并成功获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔子。2005年，李宁等在国际上首次利用体细胞克隆技术获得人乳铁蛋白基因和人乳清白蛋白转基因克隆牛；在国际上首次获得人岩藻糖转移酶转基因奶牛，并在其乳腺中实现了高效表达抗原，还在世界上首次获得人溶菌酶转移酶转基因奶牛，这是我国第一次成功研制了
14、具有商业开发前景的奶牛乳腺生物反应器。2007年，周兴等用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织，结果表明牛奶具有明显的纤溶活性，即蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。2008年，吴湃等用筛选出活性最强的重组酪蛋白启动子，构建出了新型的高效重组奶牛乳腺定位表达载体。 24、动物乳腺生物反应器的优点乳腺组织表达的重组蛋白与天然表达蛋白在结构、功能上极其相似甚至是相同。动物乳腺生物反应器生产具有生物活性的多肽药物和具有特殊营养意义的蛋白质,已成为一个新兴的转基因制药业,它的优越性有如下几点。4.1 表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性利用。DNA 重9组技术的微生物发酵工程来生
15、产的药用蛋白,由于细菌等微生物不能进行蛋白质合成后的加工, 因而生物活性低, 需要对其进行复杂的加工才能获得有活性的目的蛋白；并且具有免疫原性,而利用转基因动物生产药用蛋白却免除这些问题。 84.2 产品成本低,可以大规模生产。据计算，与生物发酵技术相比，动物乳腺生物反应器生产成本只有其百分之一。作为生物反应器的转基因动物可无限扩繁,且饲养成本低,可进行大规模的药物生产。而动物细胞生物反应器,虽然能生产具有完全生物活性的产品,但以商业生产为目的的大规模的动物细胞培养,成本会极高且培养条件要求苛刻。4.3 产品质量高,易提纯。由动物生物反应器生产的药品为纯的生物制品,避免了化学试剂及生物毒素的污
16、染。目前,某些药用蛋白生产已达每千克乳汁含几十克,生物活性与天然蛋白几乎完全一样。乳汁中几乎不含有蛋白酶，如果在目的蛋白的 N 端或者 C 端加上 His标签（不影响蛋白质的结构与功能），利用亲和层析树脂柱能够很方便将目的蛋白纯化出来。 84.5 易于扩群，进行规模化生产：作为乳腺生物反应器的转基因动物可通过繁殖或克隆技术扩大群体规模以获得最大的经济价值。45、结束语10动物乳腺生物反应器的研究在短短几十年的时同内，已取得巨大成就，某些产品虽已进入商业化生产， 但仍有一些问题需要解决。目前转基因动物的研究存在理论基础薄弱、技术不完善等问题；转入的基因在受体动物基因组中存在着随机整合、调节失控、遗传不稳定、表达率不高等问题； 转基因表达产物的分离与纯化也存在问题； 转基因表达产物的结构和生物活性是否与人体蛋白相似，人体是否对它产生免疫反应。这些都需要做进深入研究。 3、8、11综上所述， 尽管动
