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1、老年性痴呆惭瘀证病证结合树模型的初步建立及三七总皂苷干预的评价摘要初步建立老年性痴呆血瘀证病证结合树?动物模型并以三七总皂苷进行药物干预，以该药物反证该病证结合模型的稳定性。以 5 种中医表征分析方法及凝血 4 项指标、血浆 NO 含量、血浆SOD 含量评价各组树?模型的血瘀证水平；以免疫印迹试验（Western blot）检测各组树?大脑 A142 蛋白、淀粉样蛋白前体蛋白（APP） 、磷酸化 Tau 蛋白（PTau）含量；HE 染色观察各组树?大脑海马神经细胞形态，免疫组化法检测各组树?大脑海马胆碱乙酰基转移酶（ChAT）与突触素（SYP）含量。通过实验得出病证结合组树?血瘀证中医表征较
2、AD 组显著，给药组树?血瘀证表征较病证结合组减轻；与空白组相比，AD?M 树?大脑中 A142，APP 及 PTau含量降低，ChAT 及 SYP 的平均阳性截面积/A 降低，病证结合造模使这一降低加重，而三七总皂苷给药缓解了这一变化。说明 AD 血瘀证病证结合树?模型具有稳定性。 关键词老年性痴呆病； 血瘀证； 病证结合动物模型； 树?； 三七总皂苷 Abstract To establish the integration of Alzheimers disease（AD） and blood stasis syndrome tree shrew model. Panax notogin
3、seng saponins （PNS） was used to intervene the model to testify the stability of the model. The level of blood stasis of each group in the tree shrew model was evaluated by analyzing five traditional Chinese medicine（TCM） characterizations， four blood coagulation indexes， plasma nitric oxide （NO） lev
4、el， plasma superoxide dismutase （SOD） level in each group. Hematoxylin and eosin（HE） staining was used to observe the morphological changes of brain hippocampal neuron cell of each group. Immunohistochemical staining was used to assay the ChAT and SYP levels in brain hippocampus of each group.The bl
5、ood stasis characterization of the integration of disease and syndrome group was more obvious than the AD group， and that of the drug administration group was lower than that of the integration of disease and syndrome group. A142， APP， PTau， ChAT and SYP level of AD group were lower than those in th
6、e blank group， which were further reduced in the model of integration of disease and syndrome. However， the administration of PNS relieved the reduction， indicating that the AD and blood stasis integration syndrome tree shrew model is stable. Key wordsAlzheimers disease； blood stasis syndrome； integ
7、ration of disease and syndrome animal model； tree shrew； Panax notoginseng saponins 阿尔茨海默病（Alzheimers disease）是一种慢性进行性智力损害疾病，被认为是在老年群体中最普遍的一种痴呆类型1。主要表现为年老者语言、记忆、认知、情感、性格和行为的功能性缺失。目前估计已有 3 600 万人患上 AD，这个数字预计到 2050 年会变为 11 800 万2。AD 已经逐渐成为社会和医药学科发展的主要问题。先前的研究显示了 AD 的病理特征包括细胞外沉积老年斑，细胞内神经原纤维缠结的形成，产生在大脑皮
8、层、海马和大脑其他区域的胆碱能神经元损害及突触改变3。而且认识到 AD 进程涉及多种因素包括凋亡、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应、能量代谢失衡。近期研究能减慢 AD 病人病情恶化的方法包括胆碱酯酶抑制剂和 N 甲基 D 天冬氨酸（NMDA）受体激动剂，但是这些方法没有一个能对阻止 AD 病情发展起到深远意义45。中药已经有治疗 AD 很长一段历史，几千年的用药经验，传统中药已有预防和治疗 AD 丰富的理论和宝贵的经验6。传统中药很多不同组分组成的处方临床上都用来治疗 AD，如六味地黄丸、养心汤、天麻钩藤饮7。课题组前人也研究了三七总皂苷对 AD 的治疗作用8。在理论上，传统中医认为，AD
9、是由于年高肾衰精亏、气虚血少，以至髓海失养，或因脾虚痰浊内生而蒙蔽清窍，神识不清，或气滞、瘀血内阻，脏腑化生之气血不能上荣于脑，脑海不充而形成。病位在脑，其中肾虚为 AD发病的根本原因，而血瘀是其重要的病理发病因素。现研究多从肾虚证入手研究老年痴呆动物模型，少有血瘀证与 AD 的病证结合动物模型研究。树?与人类某些基因具有较高的相似性11，与灵长类有较高的亲缘关系，且在生理解剖上与人类具有极高相似度，因此，以树?为对象构建的 AD 模型更能模拟人类 AD 发病。本实验初步建立老年性痴呆血瘀证树?动物模型，并以三七总皂苷进行干预，验证该模型的稳定性。 1 材料 11 动物 中缅树?滇西亚种普通级
10、，60 只，雄性，体重 120140 g，饲养时间为 1012 月龄，由昆明医科大学实验动物学部提供，生产许可证号 SCXK（滇）K20130002，合格证号 SYXK（滇）K20130002。引进后饲养于广西中医药大学清洁级动物实验中心，温度 2225 ，湿度 50%60%，每天定时清扫粪便 1 次，适应性饲养 1 周。 12 试剂 角叉菜胶（Sigma 公司，批号 CAS9000071） ；水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号 20130513） ；D 半乳糖（Sigma 公司，批?G0625） ；鹅膏蕈氨酸（Sigma 公司，批号 BGBC2055VF） ；A2535（Sigma 公司，
11、批号 053M4804V） ；三七总皂苷（云南维和药业股份有限公司） ；BCA 蛋白定量试剂盒（Thermo，批号PICPI23223） ；A142 抗体（Abcam，批号 Ab39377） ；APP（Sigma公司，批号 SAB5200113） ；PTau（Santa cruz，批号 sc23468） ；GAPDH（CST，批号#5174） ；羊抗兔 HRP 标记二抗（批号 A0208） 、驴抗山羊 HRP 标记二抗（批号 A0181） 、羊抗鼠 HRP 标记二抗（批号A0216）均购于碧云天公司。 13 仪器 DW2000 脑立体定位仪（成都泰盟软件有限公司） ；微量注射器（上海高鸽工贸有
12、限公司） ；Tanon5200 成像系统（Tanon） ；CX41 正置显微镜（OLYMPUS 公司） ；PPTHK21B 石蜡切片机（徕克公司） ；IMS图像分析系统基尔顿生物科技（上海）有限公司；D5100 数码相机（NIKON 公司） ；Sysmex CA7000 全自动凝血分析仪（日本希森美康株式会社） 。 2 方法 21 动物分组及处理 雄性滇西亚种树?60 只，分为 4 组，每组 15 只：空白组、AD模型组（以下称 AD 组） 、AD 血瘀证模型组（以下称病证结合组） 、三七总皂苷给药组（以下称给药组） 。将 AD 组、病证结合组、给药组全部树?进行大脑定位给药的三维坐标9定位，
13、并在双侧脑室分别缓慢注射孵育好的 A25351 L （10 g?L-1）和鹅膏蕈氨酸 1 L（5 g?L-1）共 2 L 的混合溶液。空白组依照三维坐标在双侧脑室分别注射 2 L 生理盐水。待头部皮肤愈合后，将病证结合组、给药组角叉菜胶溶液腹腔注射（75 mg?kg-1） ，连续 3 d。空白组、AD 组腹腔注射等剂量的生理盐水，连续 3 d。给药组于第 4 天进行三七总皂苷溶液灌胃给药（200 mg?kg-110） ，其余 3 组树?以等容量的生理盐水灌胃，连续 10 d。 陈奔等：老年性痴呆血瘀证病证结合树?模型的初步建立及三七总皂苷干预的评价 22 树?中医表征采集 在血瘀证造模最后一天
14、 48 h 后给药组进行连续 10 d PNS 的灌胃给药，并在给药最后一天进行所有树?的足爪皮肤、鼻唇部皮肤、舌底的图像采集，观察所有树?的精神状态以及有无抓捕抵抗。 23 凝血 4 项检测 以 Sysmex CA7000 全自动凝血分析仪及 Sysmex 配套试剂盒进行检测。 24 血清 NO 含量及 SOD 活力的测定 各组血清中的 NO 含量采用硝酸还原酶法进行测定，SOD 采用WST1 法测定，均按试剂盒说明书进行操作。 25Western blot 测定脑组织中 A142，APP，PTau 含量 将树?脑组织剪成细小的碎片，加入裂解液，提取总蛋白质并进行定量。上样量为 80 g 蛋
15、白，A142（11 000） ，APP（1500） ，PTau（11 000） ，GAPDH（11 000） ，4 孵育过夜，HRP（11 000）标记的二抗孵育 1 h 后显色分析条带。 26HE 染色及免疫组化法检测脑神经细胞损伤 HE 染色：常规方法对各组树?大脑海马部位固定、洗涤与脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片和脱蜡、水化、苏木素染色、伊红染色、透明和封片，通过显微镜拍照，采集分析样本相关部位。免疫组化：各组样品玻片放在 65 恒温烘箱中烤片 30 min 后经脱蜡、水化、抗原修复、阻断，滴加一抗，湿盒孵育，室温下放置 1 h，滴加 HRP 标记广谱二抗，室温下放置 30 min，
16、DAB 染色、苏木素复染，将玻片置于二甲苯中透明后中性树胶封片，放入 65 烘箱中15 min。显微镜拍照，采集分析样本相关部位，计算阳性面积。 3 结果 31 中医表征结果分析 311 足爪、舌底、鼻唇部变化用 Photoshop CS6 计算某一图像区域 R（红色值） 、G（绿色值） 、B（蓝色值）三分量值，与空白组相比，AD 组足爪、舌底、鼻唇部平均值 R，G，B 有降低趋势，但无显著性差异，提示 AD 组足爪、舌底、鼻唇部颜色与空白组无明显差别；与 AD 组相比，病证结合组足爪、舌底、鼻唇部平均值 R，G，B均明显降低（P 313 抱头空白组、AD 组、病证结合组的抓捕抵抗率呈上升趋势，提示大脑双侧注射给药的 AD 造模树?有个别精神状态萎靡，腹腔注射角叉菜胶的血瘀证诱导证型加重了这一表征。与病证结合组相比，给药组抱头概率有下降趋势，
