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1、下一代 DNA 测序仪的原理和展望摘要：DNA 测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通量 DNA 测序技术予以解决.下一代高通量 DNA 测序技术给生命科学带来了新的生机，提供了一种新型并迅速的方法用于全基因组鉴定，mRNA、小 RNA、转录因子区域的研究以及染色质结构和 DNA 甲基化模式等研究领域.在本文中，我会重点介绍下一代 DNA 测序仪发展和原理并对其应用进展和应用前景进行前瞻性的展望.DNA 测序技术早在 DNA 双螺旋结构发现后不久就有报导(Whitfeld,1954)，当时的测序的方法为降解法(SbD)，但由于操作复杂，并没有形成规模化的应用.随
2、后 Sanger 等发明了具有里程碑式的末端终止法进行测序，该技术引入了聚合酶和测序胶从此，DNA 测序走向了大规模实用化的道路.20 世纪 80 年代启动的由多个国家参加的人类基因组计划,被称为是继曼哈顿原子计划、阿波罗登月计划之后的第三大科学计划,这个计划的完成对人类认识自身,提高健康水平,推动生命科学、医学、生物技术、制药业、农业等的发展具有极其重要的意义.2000 年 6 月 26 日由美国、英国、法国、德国、日本和中国科学家同时向世界宣布人类基因组工作草图已基本完成,2002 年 2 月又公布了“精细图”.这是基因组学研究领域的一个里程碑式的工作.随着人类基因组计划的实施 ,也推动了
3、模式生物基因组的测序,在这期间还完成了大鼠、小鼠、水稻等物种的测序.众多物种的基因组序列被解开,大量的基因通过基因组测序被识别,接下来的工作是要对这些基因的结构、功能、表达和分布进行深入的研究,急需高通量、大规模的分析手段和方法来解决这些需求.第二代 DNA 测序技术是高通量研究基因的结构和功能重要技术,推动了功能基因组和系统生物学研究的发展.在第一台全自动测序仪出现之前,使用最为广泛的测序方法就是 Sanger 在 20 世纪 70 年代中期发明的末端终止法测序技术，Sanger 也因此获得 1980 年的诺贝尔化学奖 .1.采用具有颜色的荧光染料代替同位素标记.4 种双脱氧核苷酸终止子被标
4、记上不同颜色的荧光基团产生了第一代测序技术，第一代测序技术是双脱氧链末端终止法根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A， T，C，G 四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的 PAGE 胶上电泳进行检测，从而获得 DNA 序列.第二代测序技术是焦磷酸测序法由 4 种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，适于对已知的短序列的测序分析.而第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景.而第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景.虽然
5、目前已知第三代测序技术的基本原理是在纳米孔中配置纳米电极，用电测方法测量一个 DNA 的核酸碱基排列，但开发困难，美国宣称要在 2012 年推出成熟的第三代基因测序仪，这将是对下一代测序技术的新挑战.1 下一代 DNA 测序仪原理DNA 测序策略，可以分为一下几类：（i）微芯片的电泳测序（ii）杂交测序（iii）实时测序（iv）靶向捕获基因组亚群.在这里，第二代 DNA 测序通过循环阵列测序实现，目前已经商品化.所谓循环阵列测序，简言之就是对布满 DNA 样品的芯片重复进行基于 DNA 的聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应.与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作更
6、简易、费用更低廉的优势，因此很快就获得了广泛的应用.由于时代的需要，下一代测序技术获得了革命性的突破，根据不同原理，国际各生物器械公司纷纷推出新一代测序平台，例如美国 RocheAppliedScience 公司的 454 基因组测序仪、美国 Illumina 公司和英国 Solexatechnology 公司合作开发的 Illumina 测序仪、美国 AppliedBiosystems 公司的 SOLiD 测序仪、Dover/Harvard 公司的 Polonator 测序仪以及美国 Helicos 公司的 HeliScope 单分子测序仪.下一代测序技术的核心思想是边合成(或连接)边测序，
7、即生成新 DNA 互补链时，要么加入的 dNTP 通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的 dNTP 或半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号.通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息.基于边合成边测序的思想，在 Sanger 等测序法的基础上，通过技术创新将 4 种不同的 dNTP 标记上不同的荧光，利用 DNA 聚合酶合成互补链时，每添加一种 dNTP 就释放出不同的荧光，根据捕获荧光信号，并转化为测序峰值，从而获得待测片段的序列信息.目前商业化应用的新一代测序仪 Solexa 平台就是根据这一原理设计制造的.技术的不断进步，使得单分子测序技
8、术也从梦想逐步走向了现实，HeliScope Sequencer 就是其中的典型代表.Whiteley 等提出了利用连接酶进行测序的方法，经二十多年地改进，目前，利用连接酶进行边连接边测序的高通量测序平台已经成熟，其代表就是商业化应用的新一代测序仪 SOLiD Sequencer.该技术的基本基本原理是利用 DNA 连接酶在连接过程读取序列.每一轮测序反应中，加入通用引物和半简并引物，通过连接酶将半简并引物连接到新合成的 DNA 互补链上，通过鉴别加入的半简并引物来确认互补链上某一位置的 DNA 序列.Nyrn 和 Lundin 所报道的焦磷酸测序法)，通过不断的改进，成为了新一代测序领域内，
9、最早进入新一代测序平台商业化开发的技术之一，以 454 公司开发的测序仪为代表的测序平台，在多个研究领域取得了巨大成功，使得这一技术平台在新一代测序技术领域中占据着举足轻重的地位.焦磷酸测序的基本原理是由 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 大片段、ATP 硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶等 4 种酶及其底物 5-磷酰硫酸和荧光素组成的反应体系共孵育，在 4 种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应.在每一轮测序反应中，只加入一种 dNTP，若该 dNTP 与待测模板配对，DNA 聚合酶 I 的 Klenow 大片段就可以将其掺入到合成链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi).释放出的焦磷
10、酸基团经硫酸化酶催化形成等摩尔数的 ATP，生成的 ATP 和荧光素酶共同催化底物荧光素转化为氧化荧光素，氧化荧光素发出的可见光强度与生成的 ATP 量成正比，光信号经 CCD 摄象机捕获，并通过计算机软件转化为一个峰值，经焦磷酸基团和 ATP 获得地每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比.与此同时，ATP 在双磷酸酶的催化下被游离的 dNTP 降解，光信号被淬灭，并再生反应体系，然后加入下一种 dNTP，继续互补 DNA 链的合成，进入下一个循环.2 下一代 DNA 测序仪应用下一代测序技术可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤, 避免了亚克隆过程中引入的偏差. 依靠后期强大的生物信息
11、学分析能力, 对照一个参比基因组下一代测序技术可以非常轻松完成基因组重测序, 2007 年 van orsouw 等人结合改进的 AFLP 技术和 454 测序技术对玉米基因组进行了重测序, 该重测序实验发现的超过 75%的 SNP 位点能够用 SNPWave 技术验证, 提供了一条对复杂基因组特别是含有高度重复序列的植物基因组进行多态性分析的技术路线. 2008 年 Hillier 对线虫 CB4858 品系进行 Solexa 重测序, 寻找线虫基因组中的 SNP 位点和单位点的缺失或扩增. 但是也应该看到, 由于这种高通量测序读取长度的限制,使其在对未知基因组进行从头测序的应用受到限制,这
12、部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到 850 碱基)的协助.但是这并不影响下一代测序技术在全基因组 mRNA表达谱, microRNA 表达谱, ChIP-chip 以及 DNA 甲基化等方面的应用.2008 年 Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了 RNA 深度测序, 这项工作展示了深度测序在转录组研究上的两大进展,表达计数和序列分析. 对测得的每条序列进行计数获得每个特定转录本的表达量,是一种数码化的表达谱检测, 能检测到丰度非常低的转录本.分析测得的序列, 有大于 90%的数据显示落在已知的外显子中,而那些在已知序列之外的信息通过数据分析展示的是从未被报道过的 RNA
13、 剪切形式, 3末端非翻译区 ,变动的启动子区域以及潜在的小RNA 前体,发现至少有 3500 个基因拥有不止一种剪切形式 .而这些信息无论使用芯片技术还是 SAGE 文库测序都是无法被发现的.同年 Sugarbaker 利用 mRNA 深度测序对恶性胸膜瘤和对照样品进行比较,发现了肿瘤中存在的 15 个不同的点突变，高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子 RNA 或非编码 RNA(ncRNA)研究. 测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列, 高度同源), 而且小分子 RNA 的短序列正好配合了高通量测序的长度, 使得数据“不浪费”, 同时测序方法还能在实验中发现新
14、的小分子 RNA.在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑猩猩中都已经成功地找到了新的小分子 RNA.在线虫中获得了 40 万个序列,通过分析发现了 18 个新的小 RNA 分子和一类全新的小分子 RNA ,通过对人胚胎干细胞发育前后的分析,获得了 334 个小 RNA 的表达谱带,包括新发现的 104个小 RNA 在 DNA-蛋白质相互作用的研究上,染色质免疫沉淀-深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力.染色质免疫沉淀以后的 DNA 直接进行测序,对比 ref seq 可以直接获得蛋白与 DNA 结合的位点信息相比 ChIP-chip,ChIP-seq 可以检测更小的结合区段、未知
15、的结合位点、结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段. 2007 年 Johnson 等人用ChIP-seq 对转录因子 NRSF 在 DNA 上的结合位点进行了全基因组的筛查,获得 1946 个结合位点,最小能分辨的结合位点为 50 个碱基,这些高质量的 ChIP-seq 结果提供了研究新的DNA-蛋白相互作用的内容,其中包括了胰岛发育调控网络中的重要转录因子. 同年Robertson 等人用同样的方法检测转录因子和基因组 DNA 的结合情况.这两项研究同时验证了以往用 ChIP-chip 实验检测到的结合位点,同时发现新的结合位点, Robertson 等人发现, ChIP-seq 的分
16、辨率可达 40 碱基.2008 年 Chen 等人在 Cell 上发表论文,用 ChIP-seq 检测了Nanog, Oct4, STAT3,Smad1, Sox2 等 13 个序列特异性的转录因子与基因组 DNA 的结合情况,这些转录因子都是 LIF 和 BMP 途径的重要调控分子. 这些转录因子在 ES 细胞里结合位点为我们揭示了 ES 细胞内决定 ES 细胞发育方向的调控网络. 3 展望下一代 DNA 测序测序仪虽然发明的时间不长,但是在基因组的各个研究领域都显示出其非凡的魅力, 下一代测序技术低廉的价格、 高通量的数据、 简易的样品前处理过程，将基因组学水平的研究带入了一个新的时期，也使经典分子生物科学家对基因组学研究的认识和思考上升到一个新的水平.测序通量呈指数提高, 而成本急剧降低，新型纳米孔测序法（nanopore sequencing） ，是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的.由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测.此外，纳米
