苹果汁中高深酵母的分离检测

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1、苹果酒的混菌发酵工艺研究1苹果酒的混菌发酵工艺研究1 选题的目的和意义苹果酒(Cider) ，世界第二大果酒，产量仅次于葡萄酒，苹果内主要含果糖，苹果酒酒精含量低，只有2%8%，有甜味，果味浓，适口性强。苹果是异花授粉植物，必须大片种植，产量大。苹果酒传统主要产于英国南部和法国东北诺曼底不适宜种植葡萄的地方，目前许多国家开始生产苹果酒，现代澳大利亚的苹果酒产量迅速上升，已成为世界最大的苹果酒产地，中国近几年也开始生产苹果酒。有的苹果酒含气。苹 果酒 为 低 度 酒 ， 含 有 较 丰 富 的 营 养 ， 适 量 饮 用 可 舒 筋 活 络 ， 增 进 身 体 健 康 （ 徐 岩 ，2001）

2、。苹 果 酒 是 一 种 低 度 含 酒 精 果 汁 饮 料 ， 融 合 了 啤 酒 与 果 汁 的 优 点 ， 口 感 清 醇 ，营 养 丰 富 ， 采 用 上 等 苹 果 为 原 料 ， 通 过 低 温 发 酵 ， 自 然 老 熟 的 工 艺 酿 造 而 成 。 苹 果酒 中 含 有 25种 氨 基 酸 ， 其 中 有 8种 是 人 体 不 能 合 成 的 ； 还 含 有 促 进 人 体 发 育 及 治 疗和 预 防 疾 病 的 维 生 素 (维 生 素 B12、 维 生 素 C和 肌 醇 等 )。 苹 果 酒 中 含 有 的 以 苹 果 酸为 主 的 有 机 酸 ， 有 助 于 除 去

3、人 体 内 引 起 动 脉 硬 化 和 尿 石 症 的 多 余 盐 类 ； 苹 果 酒 还 有软 化 血 管 ， 降 低 血 脂 和 开 胃 的 功 效 ； 尤 其 是 苹 果 酒 中 含 有 的 脂 肪 燃 烧 剂 丙酮 酸 ， 可 以 起 到 消 耗 脂 肪 的 作 用 ， 适 量 的 丙 酮 酸 浓 度 可 以 使 人 体 达 到 供 需 平 衡 和 胖瘦 适 宜 的 状 态 ， 长 期 饮 用 ， 不 失 为 健 身 、 减 肥 的 好 方 法 。 苹 果 中 还 含 有 钙 ， 镁 等 众多 矿 物 质 及 微 量 元 素 氯 ， 能 帮 助 人 体 消 化 吸 收 ， 维 持 人

4、的 酸 碱 平 衡 ， 控 制 体 内 平 衡 。本试验试图通过酵母属酵母和柠檬型克勒克氏酵母的混菌发酵增加苹果酒中的风味酯含量，并保证苹果酒发酵有较高的发酵效率，并优化混菌发酵酿制苹果酒的工艺（钱万英等,1997）。2 选题的依据优良苹果酒酵母主要特点之一是有较高的发酵效率，即有高的发酵速率(发酵时间短)和完全的发酵能力( 完全利用苹果汁中的可发酵性糖)，主要特点之二是形成必要的挥发性香气物质。然而，一株野生的自然酵母往往不能同时具有上述两种性能，由于高发酵效率的酵母属酵母(Saccharomyces cerevisiae)能缩短发酵时间，并能保证苹果酒发酵风味的确定性，因此，虽然形成的挥发

5、性香气物质含量较少，缺少酯香(Lacking in esterycider character)，但却是目前应用最广泛的苹果酒发酵用酵母。（Jean-Marie L，1998 ）柠檬形克勒克酵母 kloeckera apiculata(H.uvarum)由于产生过多的醋酸和乙酸乙酯以及低的酒精产量，过去一般认为是对葡萄酒质量不利的菌种。然而柠檬型克勒克酵母菌（K.apiculata）的醋酸和乙酸乙酯的产量均与其乙醇产量反相关。因此，对于苹果酒感官结构具有很好的平衡作用（GUYOT S，2001）。本试验拟通过酵母属酵母和柠檬型克勒克氏酵母的混菌发酵增加苹果酒中的风味苹果酒的混菌发酵工艺研究2酯

6、含量，并保证苹果酒发酵有较高的发酵效率。3 国内外研究进展针对不同酵母在苹果酒发酵时的贡献，人们试图利用非酵母属酵母和酵母属酵母进行混合发酵，既增加果酒中的香气物质含量，又同时保证用于果酒发酵的酵母有较高的发酵效率。但有关混菌发酵对苹果酒香气及发酵效率的影响未见详细报道（杨晓英等，2008）。4 研究内容本试验试图通过酵母属酵母和柠檬型克勒克氏酵母的混菌发酵增加苹果酒中的风味酯含量，并保证苹果酒发酵有较高的发酵效率，并优化混菌发酵酿制苹果酒的工艺。5 研究方法及技术路线5.1 菌种A 菌：非酵母属酵母-柠檬形克勒克酵母（ Kloeckera apiculata）B 菌： 酵母属酵母（Sacch

7、aromyces cerevisiae ） 。5.2 混菌发酵工艺优化实验分别以接种时间（接种柠檬型克勒克氏菌 0、1、2、3、4、5 天后接种酿酒酵母） 、接种比（柠檬型克勒克氏菌：酿酒酵母=1:5，1:3，1:1 ，3:1，5:1） 、SO 2 添加量（40mg/L，60mg/L，80mg/L，100mg/L，120mg/L）为因素，感官评价得分为主要指标，采用响应面对混菌发酵的工艺条件进行优化。5.3 指标的测定5.3.1 发酵时间：以发酵液失重量接近恒定值所需发酵时间表示5.3.2 生长曲线：发酵过程中，每24 h 称失重一次，直至失重量恒定不变。以 CO2产生量计发酵程度。5.3.3

8、 酸测定：酸度计（pH计）和酸碱滴定5.3.4 可溶性固形物测定：手持测糖仪5.3.5 总糖、还原糖测定：DNS比色法（李军鹏等，2010）苹果酒的混菌发酵工艺研究35.3.6 酒精度测定：酒度计5.3.7 多酚测定:总酚的测定：Folin-Ciocalteus法（李静等，2007）酚组成测定：HPLC 测定（郝慧英等， 2004）5.3.8 黄酮含量测定：比色法（李红等，2003）5.3.9 抗氧化能力（DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、总还原能力）分光光度计法（杜晓丹等，2006）5.3.10 香气成分测定：气质联用（汪立平等，2003 ）5.3.11 感官评价：选择10名经过专业

9、训练的人员组成品评小组，进行感官评价，标准如表1，再运用模糊数学综合评判苹果酒的感官特性。项目 评价标准 评价具有苹果酒应有的色泽，悦目协调、澄清、透明、有光泽很好具有苹果酒应有的色泽，澄清透明，无明显悬浮物 好苹果酒光泽略有不符，澄清，无悬浮物 一般该产品应有的色泽明显不符，微浑，失光或人着色差色泽不具备应有的特征 很差果香、酒香浓馥幽雅，协调悦人 很好果香、酒香良好，尚悦怡 好果香酒香较少，但无异香 一般果香不足，或不悦人，或有异香 差香气香气不良，使人厌恶 很差酒体丰满、有新鲜感，醇厚协调、舒服、爽口、回味绵延很好酒质柔顺、柔和爽口、甜酸适当 好酒体协调、纯正无杂 一般酒体寡淡、不协调，

10、或有其他明显的缺陷 差口味酸、涩、苦、平淡、有异味 很差苹果酒的混菌发酵工艺研究4典型完美、风格独特，幽雅无缺 很好典型明确、风格良好 好有典型性，但不够怡雅 一般典型性不明显 差风格不具有苹果酒的典型性 很差6 预期结果分析两种酵母接种量及该两种接种量的交互因素对混菌发酵效率得影响；对接种量、苹果汁营养条件进行正交试验并确定一种适宜条件，使混合酵母在该条件下，具有柠檬形克氏酵母高产酯能力特和酵母属酵母高发酵效率特性，酿制出香气悦人，酒体醇厚的苹果酒。7 研究的创新点针对高发酵效率的酵母属酵母发酵的苹果酒缺少酯香的不足之处，各国苹果酒香气物质研究者正在不断寻找提高产品质量的方法，以便控制苹果酒

11、的风味，提高苹果酒的香气质量（Bisson L F，2003）。人们认为非酵母属酵母(non-saccharomycesspp .)可以有效地增加果酒的酯香，对果酒香气风味有积极影响的非酵母属酵母有柠檬形克勒克酵母( Kloeckeraapiculata)，法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniasporavalbyensis)，美极梅氏酵母(Metschnikowia pulcherrima)。然而非酵母属酵母的发酵效率普遍较低，所以人们试图利用非酵母属酵母和酵母属酵母进行混合发酵，既增加果酒中的香气物质含量，又同时保证用于果酒发酵的酵母有较高的发酵效率。但有关混菌发酵对苹果酒香气及发酵效率的影

12、响未见详细报道。由于现代苹果酒的香气类似于淡白葡萄酒，因此混菌发酵对苹果酒香气及发酵效率的影响对白葡萄酒的研究也有参考意义（Wang L，2004）。8 所需主要仪器设备和试剂8.1 材料8.1.1 菌株A 菌：非酵母属酵母-柠檬形克勒克酵母（ Kloeckera apiculata）B 菌： 酵母属酵母（Saccharomyces cerevisiae ） 。8.1.2 苹果苹果品种为红富士，采自陕西扶风县果园。8.1.3 试剂酵母膏、蛋白胨、琼脂粉、抗坏血酸、葡萄糖、苹果酸、蔗糖、氯化钠、亚硫酸苹果酒的混菌发酵工艺研究5钠等。8.1.4 培养基YEPD 液体培养基: 酵母浸粉1%，蛋白胨2

13、%，葡萄糖2%; 苹果汁培养基: 将经过4 层纱布过滤的鲜榨苹果汁糖度调节到20 Brix，酸度调整为 5 0 g /L( 以苹果酸计) 。8.2 仪器与设备PHS-3C 型酸度计，上海虹益仪器厂;DPX-9002B-1 型智能恒温培养箱，上海福玛实验设备有限公司; UV1700 型紫外分光光度计，日本岛津 ; BCN-1360B 型生物洁净工作台，哈尔滨东联电子技术开发公司; CX31 显微镜，奥林巴斯。9 工作进展安排现已基本确定方案，拟于 2012 年 3 月左右开始试验。10 研究工作中面临的技术难点10.1 由于条件限制，不能采取多种香气成分的分析法对苹果酒中的香气物质进行定量分析。

14、10.2 鉴于挥发性物质对苹果酒香气的贡献，应在酒陈酿一段时间后再进行进一步的品评，但实验的时间可能比较紧张，不能对苹果酒进行充分的陈酿。参考文献徐岩. 一种苹果酒酵母和用该酵母发酵酿制苹果酒的方法P. CN: 1 335 392A, 2001.钱万英, 余嗣明. 糖类的定量测定-3,5-二硝基水杨酸比色定糖法,基础生化试验指导M. 安徽: 安徽大学出版社,1997.李静 果酒酿造中优良酵母菌株的筛选J 酿酒，2008，35( 2) : 63 65张菡 优良苹果酒酵母优选及苹果酒香气调控技术研究D 杨凌: 西北农林科技大学，2006汪立平，徐岩，赵光鳌 顶空固相微萃取法快速测定苹果酒中的香味物

15、质J 无锡轻工大学学报，2003，22( 1) : 2 6杨晓英，丁立孝，梁美霞，等 苹果酒优良酵母菌株的筛选J 青岛农业大学学报: 自然科学版，2008，25( 1) : 28 33Wang L, Xu Y, Zhao G, et al. Rapid analysis of flavor volatiles in apple wine using headspace solid-phase microextraction J. J Inst Brew, 2004, 110(1): 57-65.Tahla B, Lucas D C, Andres A, et al. Selection of

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