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1、1浅谈急性心肌梗死患者外周血来源论文关键词 心肌梗死；内皮祖细胞； CXCR4 论文摘要目的观察急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI) 患者外周血来源内皮祖细胞(endothelialprogentiorcells，EPCs)CXCR4 受体表达及功能的变化。方法选择 AMI 患者 15 例，对照组非 AMI 患者 15 例，抽取外周血密度梯度离心法获取单个核细胞，培养 7d 后对贴壁的细胞进行分析。激光共聚焦显微镜鉴定 FITC 标记荆豆凝集素 I 和 DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白双染色阳性细胞为 EPCs。应用改良的Boyden 小室测定 EPCs
2、对基质细胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-I)的迁移能力，流式细胞仪测定 EPCs 的CXCR4 的表达，RT-PCR 法测 CXCR4 的 mRNA 表达。结果 AMI患者外周血 EPCs 数目增多，对 SDF-1 的迁移能力增强，其表达CXCR4 上调，CXCR4 的 mRNA 合成增强。与对照组相比，差异均具有统计学意义(P0.01)。结论 AMI 患者外周血来源 EPCs 的CXCR4 受体表达上调，功能增强。 众多证据表明，循环中内皮祖细胞(endothelialprogentiorcells，EPCs) 在成体血管形成中起了重要作2用。
3、动物和临床实验均表明，静脉注射 EPcs，能显著促进缺血组织的血管新生及功能恢复，而同样条件下注射成熟内皮细胞却收效甚微。这些均表明了 EPcs 在机体生理或病理情况下对血管形成的重要作用。因而 EPcs 也成为研究的热点。正常人外周血循环中有一定数量的来源于骨髓的 EPcs，参与维持血管壁的完整性。但冠心病人的EPCs 数量减少，功能减低，且这种损害与冠心病的危险因素呈相关性。作为冠心病的一种特殊类型急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI) ，在急性期由于存在自体骨髓动员现象，EPCs 却是升高的。但升高后的 EPCs 功能如何，少有报道。笔者研究了 AMI
4、 急性期 EPCs 的 CXCR4 受体的变化，来试图解释其功能的变化，以期为提高 EPCs 治疗效果提供一种新的思路。1 资料与方法 11 一般资料 AMI 患者 15 人，对照组为因非典型胸痛而行冠状动脉造影并排除冠心病的患者 15 人，2 组临床资料。排除近期内有炎症、肿瘤、手术及合并糖尿病，服用雌激素、他汀类药物等影响 EPCs 因素的患者。 312 材料与试剂 淋巴细胞分离液(相对密度 1.077)购自上海生化试剂二厂；EGM-2-MV 内皮细胞培养基购自 Clonetic 公司；胎牛血清(Fcs)购自 GIBCO 公司；人纤维连接蛋白购自 Chemicon 公司；FITC 标记荆豆
5、凝集素 I(FITC-UEA-I)、DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白 (DiI-acLDL)购自 Sigma 公司；基质细胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1)、FITC 标记的抗 CXCR4 抗体购自深圳晶美生物公司；改良的 Boyden 小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂；TRIzol 试剂购自 Invitrogen 公司；cDNA 第一链合成试剂盒、TaqDNA 聚合酶和 dNTP 购自 Fermcntas 公司。引物由北京奥科公司合成。 13 方法 131EPCs 的分离、培养与鉴定每例患者取外周血15ml，分别常规密度梯度离心法分离单个核细胞
6、。将单个核细胞以1105 个细胞/孔的密度接种在人纤维连接蛋白包被的 6 孔培养板。加入 EGM-2-MV 培养基及 5FCS 于 5CO 培养箱中 37 恒温培养。培养 4d 后，用 PBS 洗掉非贴壁细胞。为了维持细胞原先生存环境，换为 EGM-2-MV 培养基，加入 20的细胞来源患者血清，继续培养至 7d 后进行各种检查分析。贴壁细胞用 DiI-4acLDL、FITC-UEA-I 行荧光化学染色，激光共聚焦显微镜下观察，染色双阳性细胞被认为是正在分化的 EPCs。每孔随机选择 15 个视野(200)对 EPCs 计数。取其平均值换算成每平方毫米的细胞个数记录。 132EPCs 对 SD
7、F-l 的迁移能力检测用胰酶消化贴壁细胞并计数。将含 SDF-1 质量浓度浓度为 100ng/ml 的培养液(EGM20患者血清)30l 注入改良的 Boyden 小室的下室，将含310 个 EPCs 的培养液 (同上)50l 注入上室，培养 5h，刮去滤膜上面的未移动细胞，用甲醇固定，Giemsa 染色，随机选择 5 个显微镜视野(200) 计数迁移到低层的细胞。 133 流式细胞术分析消化后的部分 EPCs 离心，沉淀重悬于 PBS 中，取约 5105 细胞，加入 FITC 标记的抗 CXCR4 抗体及同型对照，于流式细胞仪(FACSCalibur ，BD 公司) 上进行阳性细胞记数，每次
8、分析获取 10 个细胞。 134RT-PCR 检测应用 Trizol 提取上述收集的 EPCs 总RNA，测定 RNA 浓度后反转录为 cDNA 再进行 PCR 反应。CXCR4 引物序列：上游引物 5AATCTYCCTGCCCACCATCT3 ，下游引物 5GACGCCAACATAGACCACCT3 ，产物为 367bp。内参照为GAPDH，上游引物：5 TATGATGACATCAAGAAGGTGG3 ，下游引物：5CACCACCCTGTFGCTGTA，扩增片段 213bp。反应产物用 2琼脂糖凝胶电泳。图像分析软件5(BandLeaderApplication3.0)分析电泳条带灰度值，目
9、的基因mRNA 表达的相对强度目的基因条带灰度值/ 内参照条带灰度值。135 统计分析采用 SAS8.1forwindows 统计软件进行数据处理。计量资料以均数标准差(s)表示，两组间均数比较用成组 t 检验，计数资料采用 Fisher 法进行检验，以 P80 的细胞双染色阳性，说明这些细胞能内吞acLDL 和结合 UEA-1，可被认为是正在分化的 EPCs。随机选择15 个视野计数双阳性细胞，见 AMI 组患者外周血来源 EPCs 为(43954)个/mm ，明显高于对照组 (26337)个/mm ，P0.01。22EPCs 对 SDF-1 迁移能力的比较 与对照组相比，AMI 组外周血来
10、源 EPCs 对 SDF-1 的迁移能力明显增强。17519)vs(9811)个/mm ，P0.01 。 623 流式细胞仪测定 EPCs 表面 CXCR4 的表达 AMI 组为(69.512.1)，对照组为(58.710.4) ，AMI 组较对照组明显增高(P 24EPCs 中 CXCR4mRNA 表达测定 AMI 组 CXCR4mRNA 表达的相对强度为(0.80.11)，对照组为(0.50.09)，AMI 组明显高于对照组。 (P0.05)。 3 讨论 本实验中发现，AMI 后急性期外周血中 EPCs 数量增多，对SDF-l 的迁移能力增强，同时 EPCs 的 CXCR4 受体表达增高，
11、mRNA 合成增强。 AMI 后，由于缺血缺氧、组织损伤、炎症因子释放增多，可致自体骨髓干细胞动员，因而外周血中 EPCs 数量增多。EPCs 如何归巢到受损心肌处以发挥生成血管的作用，目前认为主要是靠 SDF-1 与其受体 CXCR4 相互作用来完成。研究发现 AMI 后急性期内，心肌局部 SDF-1 表达明显增高，SDF-1 可通过 EPCs 上CXCR4 受体剂量依赖性地提高 EPCs 的迁移、归巢向缺血组织的能力。与心肌局部 SDF-1 升高相对应的是 EPCs 上 CXCR4 表达上调，笔者在体外实验中证实了这种上调可导致 EPCs 对 SDF-1 的迁移能7力增强，因而推测 AMI
12、 后外周血中 EPCs 的 CXCR4 表达上调，加速了 EPCs 向损伤心肌处归巢，以保护或代偿生成血管。 EPCs 的 CXCR4 上调，考虑由多种原因造成。一方面 AMI后从骨髓中动员到外周血中 EPCs 比例、数量增多，另一方面，AMI 后可释放多种细胞因子，其中便包含 VEGF、SCF、IL-6 等。而实验表明 VEGF、SCF、IL-6 可直接作用于 CD34 细胞，诱导CXCR4 的表达。尽管 AMI 后心肌局部 SDF-1 表达增多，但由于基质金属蛋白酶、中性蛋白酶等的作用，血液及骨髓局部中 SDF-1 却是降低的，SDF-1 的下降，也可使其配体 CXCR4 相对上调，这些情
13、况更有利于干细胞的动员，而不利于动员出的干细胞再回归于骨髓中。 心肌局部表达 SDF-1 升高是短暂的，AMI 后 7d 便降低，同时自体骨髓干细胞动员也仅限于急性期，长期冠心病对 EPCs 的数量与功能是有损害的，这也是依靠机体自身的代偿起不到治疗作用的原因之一。但是可以利用 SDF-1 与 CXCR4 相互作用来干预治疗。动物试验表明，转染 SDF-1 基因或直接注射 SDF-1，均能提高局部SDF-1 的水平，促进自体或移植的 EPCs 归巢增强局部血管生成。国内学者进行动物试验表明应用 G-CSF 或他汀类药物，均能大幅提高心肌梗死后外周血中 EPcs 的数目，促进梗死区血管再生。而且有报道表明 G-csF 在体内能间接引起 EPcs 的 cxcR4 表达上调。相反，用相应抗体阻断 cxcR4 的表达后，治疗 AMI 的作用明显降低。因而围绕 sDF-1 与 cxcR4 相互作用，如何提高 AMI 后自体或移植的8EPCs 的 cxCR4 表达，如何提高 AMI 后心肌局部的 SDF-1 的表达，从而促进 AMI 后 EPCs 的血管生成作用，将是一个较有前景的治疗方法。
