《人多能干细胞向胰腺β细胞和神经细胞定向分化的机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人多能干细胞向胰腺β细胞和神经细胞定向分化的机制研究（30页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、项目名称： 人多能干细胞向胰腺 细胞和神经细胞定向分化的机制研究首席科学家：起止年限： 2012.1 至 2016.8依托部门： 教育部一、关键科学问题及研究内容（一） 关键科学问题 目前人多能干细胞定向分化尚未在“功能成熟”和“分化效率”两个难点上取得突破。基于我们已经建立的稳定体外分化体系，我们认为解决这两个问题的一个关键点在于对分化过程中的干/祖细胞的特化、形成阶段和终末功能细胞成熟阶段的分子调控网络开展系统性研究。干/祖细胞具有扩增并能进一步分化为成熟功能细胞的能力，了解干/祖细胞的产生机制，并扩增和富集干/祖细胞，进而提高分化效率，将为下一步研究终末分化细胞的成熟机制打下重要基础。终
2、末功能细胞成熟阶段则直接关系到终末细胞的功能是否完全。因此我们认为需要在这两个阶段寻找促进干/祖细胞特化、产生和扩增以及终末功能细胞成熟的关键因子，并深入分析其分子调控机理。 解决这两个问题的另外一个关键点在于分析人体内胚胎期细胞分化和成熟过程相对模式生物的独特性，为人多能干细胞体外分化提供新的线索。体外定向分化体系的建立主要依据对体内胚胎期细胞分化和功能成熟的调控机制的研究，但是目前人多能干细胞定向分化主要参考小鼠等模式生物的发育机制研究，而根据这些模式生物的发育机制指导人多能干细胞定向分化存在很大的局限性：一方面种属差异造成人细胞分化和功能成熟具有其独特性，另一方面人胚胎发育时程较其他模式
3、生物更长，发育过程中人体细胞分化和功能成熟的机制比其他模式生物更为复杂。因此，要解决目前体外分化中一系列问题，需要深入研究人体内胚胎期细胞分化和功能成熟的过程，以及该过程相比其他模式生物的独特性。综上所述，结合我们团队在人多能干细胞向胰腺 细胞和神经细胞定向分化上的工作基础，本项目提出以下关键科学问题：1）体外分化体系中促进胰腺干/祖细胞和神经干/祖细胞特化、产生的关键因子是什么？这些关键因子是如何被调控的？2）体外分化体系中促进胰腺 细胞产生和功能成熟的关键因子是什么？这些关键因子是如何被调控的？3）体外分化体系中终末神经元的生理功能是如何获得的？4）人体内胚胎期胰腺 细胞及神经细胞的分化和
4、功能成熟过程相对模式生物有何独特性？如何借鉴这种独特性来为人多能干细胞向胰腺 细胞及神经细胞定向分化寻找新的线索？ （二） 主要研究内容 围绕上述关键科学问题，本项目的主要研究包括四个方面： 1.人多能干细胞向胰腺 细胞定向分化的机制研究基于我们已建立的稳定的人多能干细胞向胰腺 细胞定向分化体系，从mRNA、蛋白表达、表观遗传学等多个水平分析目前体外分化体系中胰腺干/祖细胞、胰腺 细胞的基因调控网络，以分析目前分化体系的关键缺陷。根据这些线索，进一步寻找促进胰腺干/祖细胞形成的关键因子以及促进胰腺 细胞形成和功能成熟的关键因子，进而阐明这些关键因子的分子调控机制。此外，由于胰腺属于内胚层器官，
5、其干祖细胞早期特化过程的关键调控信号通路与其他内胚层器官如肝脏、胸腺等相比必然有其特异性。我们将系统比较在内胚层发育过程中，胰腺干/祖细胞早期命运决定的关键信号通路与其它内胚层组织细胞的异同，从而寻找特异性调控胰腺干/祖细胞前期特化的关键因子和相关信号通路。2.分析人胰腺 细胞分化和功能成熟途径的独特性 一方面，通过分析人体内胚胎期从胰腺开始形成到胰腺 细胞功能成熟的过程中不同阶段的胚胎胰腺样本，来系统地分析描绘人体内胚胎期胰腺 细胞的分化和功能成熟过程，为体外人多能干细胞向胰腺 细胞定向分化提供重要参考；在此基础上，我们还将系统分析内胚层其他器官如肝脏等胚胎期的样本，寻找其特化与发育的关键转
6、录因子和信号通路，并比较其与胰腺组织特化的差异，从而分析人胰腺细胞发育过程的独特性。另一方面，在胰腺干/祖细胞形成阶段、胰腺 细胞成熟阶段，从基因表达、表观遗传学等多个角度系统分析胰腺发育过程中的关键调控基因的表达模式，并与模式生物胰腺发育过程相应基因的表达模式进行比较分析，以揭示人体内胚胎期胰腺 细胞分化和功能成熟过程的独特性。同时分离人体内胚胎期胰腺 细胞分化和成熟过程中不同阶段的细胞，利用我们已建立的分化细胞体内功能成熟体系研究人体内胰腺 细胞功能成熟过程，并与模式生物 细胞功能成熟过程比较，分析其独特性。根据这些独特性，在体外分化体系中进一步寻找促进胰腺 细胞分化和功能成熟的关键因子，
7、并研究其调控机制。3.人多能干细胞向神经细胞分化中早期特化分子机理的研究 采用我们近期建立的人多能干细胞向神经细胞早期分化的高效模型，运用转录组测序和甲基化 DNA 免疫共沉淀测序技术（MeDIP-seq）检测人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中的时空显著变化基因和甲基化修饰变化图谱，分析早期神经分化过程中的关键调控网络。同时，采用人类激酶基因组（kinome） shRNA 干扰文库在人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中进行功能筛选，寻找调控人早期神经分化过程中的关键激酶。最后，利用来自人体内胚胎期的神经组织和分离的神经干/祖细胞对筛选鉴定的关键基因进行进一步的验证和作用机理研究。4.人多能干
8、细胞向神经细胞分化的功能性研究 基于已经建立的人多能干细胞向运动神经元和多巴胺能神经元分化体系，系统地从电生理特征、离子通道、神经递质等方面研究终末神经元的功能成熟过程，以揭示体外神经分化过程中神经元的功能形成机制。同时分析人体内胚胎期神经发育后期与神经元功能相关的关键基因表达的时空表达变化，结合体外分化神经元的功能形成的分析研究，分析目前体外分化神经元功能形成过程中的可能缺陷，为获得功能成熟的神经元提供新的线索。二、预期目标（一）总体目标 系统性研究人多能干细胞定向分化为胰腺 细胞和神经细胞过程中的分子调控机制；揭示人体内胚胎期胰腺 细胞和神经细胞分化和功能成熟的规律与独特性，为体外定向分化
9、提供参考；从而最终能够高效获得人多能干细胞来源的功能成熟的胰腺 细胞和神经细胞，为人多能干细胞用于糖尿病和神经退行性疾病的临床治疗奠定理论基础。通过本项目的实施，使我国在多能干细胞向胰腺 细胞和神经细胞定向分化研究领域达到国际领先水平，培养一批优秀的中青年学术带头人和学术骨干，建立一支干细胞研究领域的高水平研究团队。 （二）五年预期目标 1. 通过对人多能干细胞向胰腺 细胞定向分化过程中胰腺干/祖细胞形成阶段以及胰腺 细胞形成和功能成熟阶段的系统分析，鉴定促进胰腺干/祖细胞产生以及胰腺 细胞产生和功能成熟的关键因子，进而阐明体外分化过程中胰腺前体细胞、内分泌前体细胞形成以及胰腺 细胞形成和功能
10、成熟的调控机制。此外，还将通过人多能干细胞的定向分化体系，系统比较分析胰腺干/祖细胞特化过程的关键因子与其他内胚层组织细胞如肝脏、胸腺在转录因子和信号通路调控等方面的异同，从而寻找到胰腺的特异性调控因子。在此基础上建立高效获得人多能干细胞来源的功能成熟的胰腺 细胞的体外分化体系，为人多能干细胞在治疗糖尿病上的临床应用奠定理论基础。2. 通过分析人体内胚胎期胰腺 细胞分化和功能成熟的过程，进而与体外分化体系、模式生物的胰腺 细胞分化和功能成熟过程进行相互比较，揭示人体内胚胎期胰腺 细胞的分化和功能成熟过程相对于模式生物的独特性；此外，还将系统比较人体胚胎期内胚层其他器官如肝脏等发育过程中，与胰腺
11、细胞在关键转录因子和信号通路方面的异同，从人体内器官发育角度寻找胰腺细胞特化与发育的特异性调控机制。这些工作将为体外分化体系的进一步优化和完善提供新的重要线索。 3. 通过功能筛选和基因组高通量分析手段筛选鉴定调控人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中的关键基因，阐明关键激酶和其它分子在人早期神经分化过程中的功能以及作用的分子机理，为后期高效获得功能性神经元奠定基础。4.通过系统分析人多能干细胞向运动神经元和多巴胺能神经元定向分化过程中神经元功能形成的过程，揭示体外分化过程中神经元的功能形成机制，进而优化体外分化体系以期获得功能成熟的运动神经元和多巴胺能神经元，为未来临床应用奠定基础。 5. 取
12、得具有国际影响力的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表高水平论文30 篇左右。培养高水平博士后 510 人、研究生 30-40 人；建立一支活跃在干细胞研究领域的创新团队和中青年学术带头人队伍。三、研究方案（一） 学术思路 目前人多能干细胞向胰腺细胞和神经细胞定向分化的基本体系虽已建立，但在现有体系尚未获得功能完全成熟的细胞，并且分化效率较低。形成这两个问题的主要原因在于，对分化过程中促进细胞分化和功能成熟的关键因子和相关机制缺乏深入的研究。因此，我们将围绕关键科学问题，在已建立的稳定分化体系的基础上，开展人多能干细胞向功能成熟的胰腺细胞和神经细胞高效分化的分子调控机制研究。我们将重点研究体外
13、定向分化过程中的干/祖细胞形成阶段和终末功能细胞成熟阶段的分子调控网络，寻找促进细胞分化和功能成熟的关键因子。分化过程中的干/祖细胞形成阶段对于提高分化效率有着重要的影响，而分化后期的功能细胞成熟阶段则直接关系到能否获得功能完全成熟的分化细胞，因此我们将针对这两个阶段开展重点研究，我们的研究思路如下： 1）结合基因打靶建立报告体系技术和表面分子标记分选两种手段，建立标记、分离和纯化分化特定阶段细胞的体系。2）从mRNA、蛋白、表观遗传等多个水平对干/祖细胞和终末细胞进行系统的研究，分析目前体外分化体系的关键缺陷。3）从细胞功能的角度来分析细胞分化和成熟的方向是否正确。体外细胞分化途径是否正确，
14、一个重要指标就是终末的细胞是否功能成熟。我们将结合终末细胞的体外功能评价体系和分化细胞的体内功能成熟体系来判断干/祖细胞和终末细胞的分化方向，同时进行功能性筛选。4）研究细胞间相互作用对细胞功能成熟的影响。体内发育过程中，细胞之间的相互作用对于细胞功能成熟有重要的影响。但目前体外定向分化中大多关注单一细胞类型的分化过程，而缺乏细胞之间如何相互促进分化成熟的研究，因此需要加强这方面的研究。5）目前人多能干细胞定向分化主要参考小鼠等模式生物的发育机制研究，但人与模式生物的种属差异等因素导致仅根据模式生物的发育机制指导人多能干细胞定向分化存在很大的局限性。我们将分析人体内胚胎期胰腺细胞和神经细胞分化
15、和功能成熟过程相对于模式生物的独特性；以及胰腺相对于人体内胚层其他组织细胞如肝脏在发育调控机制上的异同，从而从器官特化角度寻找胰腺发育的独特性；从而为人多能干细胞体外分化提供新的线索, 以建立高效获得功能成熟的人多能干细胞来源的胰腺细胞和神经细胞的体外分化体系。 （二） 主要技术途径根据上述学术思路，本项目在人多能干细胞向胰腺 细胞和神经细胞两个谱系的定向分化上开展研究，其中课题一主要在体外分化体系中研究人多能干细胞向胰腺 细胞分化的关键因子和调控机制，课题二主要分析人体内胚胎期胰腺 细胞分化和功能成熟过程相对于模式生物的独特性，为体外分化提供新的线索，课题三和课题四分别重点研究人多能干细胞向
16、神经分化过程中早期神经特化和晚期神经元功能成熟的分子调控机制。主要技术途径如下：课题一、二 人多能干细胞向胰腺 细胞分化的机制研究技术途径如下图所示：1. 在我们现有稳定的人多能干细胞向胰腺 细胞分化体系基础上，利用同源重组技术建立含有关键转录因子报告体系的人多能干细胞系，进一步筛选寻找能够特异标记胰腺干/祖细胞和 细胞的细胞表面分子标记，分离纯化分化过程中胰腺干/祖细胞和 细胞。同时，通过类似手段分离纯化人多能干细胞分化来源的其他内胚层组织细胞如肝脏细胞。2. 分别对纯化的各类细胞进行详细分析鉴定：1）采用转录组测序、蛋白质组学技术和甲基化 DNA 免疫共沉淀测序技术（MeDIP-seq）对纯化的分化细胞进行mRNA、蛋白质和表观遗传水平的系统分析，分析体外分化过程中细胞谱系分化途径；2）利用我们已建立的小鼠体内功能成熟的技术平台，将纯
