《大豆异黄酮对奶牛肠系淋巴结和脾脏淋巴细胞白介素2、干扰》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大豆异黄酮对奶牛肠系淋巴结和脾脏淋巴细胞白介素2、干扰（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、大豆异黄酮对奶牛肠系淋巴结和脾脏淋巴细胞白介素 2、干扰素 和雌激素受体 mRNA表达的影响 1王明 1 孙志刚 1 刘文奇 2 杨柳 1 方洛云 1 蒋林树 1*2（1.北京农学院动物科技学院反刍动物营养实验室，北京 102206；2.北京首都农业集团有限公司，北京 100029）摘要：本试验旨在研究大豆异黄酮（SI）对奶牛脾脏与肠系淋巴结中淋巴细胞增殖、活化及细胞因子水平的影响。采用单因素试验设计，不同浓度的 SI0.00(对照) 、0.25、1.00、5.00、25.00 和 100.00g/mL与淋巴细胞分别共育 4、24 和 48h，用酶联免疫法测定培养上清液中的白介素 2（IL-2
2、） 、白介素 4（IL-4） 、干扰素 （IFN-）浓度，用 RT-PCR 方法测定淋巴细胞中雌激素受体 （ER- ）mRNA 表达量。结果表明：添加 1.00 和0.25g/mL浓度的 SI 能显著提高脾脏淋巴细胞中 IL-2 和 IFN-水平（P95%，用完全培养液将细胞稀释成0.93106 个/mL。将 SI 用二甲基亚砜（ DMSO）溶解配成不同梯度浓度的储存液，使用前用 RPMI-1640 培养液进行稀释。1.2 主要的仪器与试剂SI纯度98%，购自陕西森弗生物科技有限公司；RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司；牛淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司产品；美洲胎牛血
3、清购自美国Hyclone公司，刀豆蛋白A(ConA)购自美国sigma公司；总RNA提取试剂（Trizol Reagent）购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒购自美国Fermentas 公司；核酸染料（SYBR Green）购自日本TOYOBO公司。1.3 试验设计与方法在细胞悬液中加入ConA（5g/mL ）以及1%的SI稀释液，使SI的终浓度分别为0.00（对照） 、0.25、1.00、5.00、25.00、100.00g/mL ，将调整好的细胞悬液加入6孔板中，每孔加入3mL细胞悬液，每组3个重复。置于5%CO 2培养箱中常规培养4、24和48h，终止培养后进行离心，分别收集
4、上清液和细胞，细胞中加入1mL总RNA提取试剂Trizol（美国Invitrogen公司）进行裂解。上清液用于各细胞因子的测定。1.4 试验指标的测定1.4.1 培养上清液 IL-2、IL-4 和 IFN-浓度的检测收集上述共培养的上清液,采用双抗体夹心酶联免疫（ELISA）法检测IL-2 、IL-4和IFN-浓度,按照各ELISA试剂盒说明书进行操作,在波长450 nm处用酶标仪测定各孔的吸光度(OD)值,从相应的标准曲线查得各样品IFN- 、IL-2和IL-4 的浓度。1.4.2 实时定量 PCR（real-time PCR ，RT-PCR）法测定 ER-mRNA表达量提取细胞总RNA 1
5、0并定量分析后，取2g 常规逆转录成cDNA 进行RT-PCR反应并进行分析。20L反应体系：50mol/L的上、下游引物各0.25L 、cDNA样品2L、SYBR Green 10L.引物序列及反应条件见表2。PCR产物4保存。将对照组的总RNA逆转录为cDNA作为标准品，依次2倍浓度梯度稀释，使cDNA模板含量为1/2、1/4 、1/8、1/16，以制作标准曲线。采用2 Ct 法对待测样本进行分析,重复检测3次。按以下公式计算ER- mRNA相对表达量：Ct=Ct目的基因 -Ct内参基因 ，Ct=Ct对照组 -Ct试验组 ，F值=2 -Ct。表 1 实时定量 PCR 引物序列及参数Tabl
6、e 1Sequences and parameter of primers for the real-time PCR项目 Items序列 Sequences （5-3 ）温度 Temperature/时间 Time/s循环数 Cycles长度Size/bp上游：TAACTCTCCTGTCTCCTATAAC雌激素受体 ER-下游：CTGGCAATGGATGGCTAA95587230154540 244上游：CTTCGCGGGCGACGATGC-肌动蛋白-actin下游：CGAACATGGCTGGGGTGTTG95627230154540 3411.5 数据统计与分析试验数据使用Excel进行整
7、理，采用 SAS 6.12软件包中的GLM过程（一般线性模型过程）对试验数据进行方差分析，利用Duncan 氏法进行多重比较， P0.05） 。24 h后，25.00g/mL 组IL-2浓度分显著（P0.05） ，添加0.25g/mL组IL-2 浓度与对照组相比有上升趋势，但差异也不显著（P0.05） 。48 h后，除1g/mL 组显著高于对照组外，其余各试验组均显著低于对照组(31.28 pg/mL) （P 0.05） 。24 h后，除0.25和100.00g/mL 组显著高于对照组外（P0.05） 。48 h后，各试验组间均低于对照组，但差异均不显著（P0.05） 。共育时间对奶牛脾脏淋巴
8、细胞分泌IL-4的影响差异不显著（P0.05） 。表 2SI 添加水平对奶牛脾脏淋巴细胞 IFN-、IL-2 和 IL-4 浓度的影响SI 添加水平 Supplemental levels of SI项目 Items时间 Time/h0.00 0.25 1.00 5.00 25.00 100.004 27.790.88Cc 33.651.1Bc 33.781.59Bb 38.430.61Aa 35.350.55Bb 33.662.4Bb24 32.381.41Eb 61.821.16Aa 35.850.85Db 36.880.71CDb 38.920.42Ba 38.020.43BCa干扰素I
9、FN-48 35.480.79Ca 44.71.18Ab 38.210.29Ba 33.70.83Dc 33.770.5Dc 37.790.97Ba4 27.731.07Cc 28.490.82Cc 27.120.89Cc 27.360.28Cc 32.760.82Bb 35.410.31Aa24 31.940.8Aa 32.880.37Ba 31.110.17Cb 30.130.31Ca 35.770.76Aa 33.40.47Bb白介素 2 IL-248 31.280.23Bb 30.270.41Cb 33.360.76Aa 29.060.47Db 28.660.4Dc 28.280.56
10、Dc4 21.050.83Ca 22.950.39ABa 22.040.25BC 23.521.05Aa 21.520.27Ca 23.210.45Aa24 21.430.11ABa 22.880.97Aa 20.940.8Ba 20.421.27Bb 20.851.44Ba 23.220.9Aa白介素 4 IL-448 22.191.56Aa 20.710.88Ab 21.811.22Aa 22.150.41Aab 20.481.23Aa 22.280.19Aa同一指标、同列数据肩标相邻小写字母表示差异显著(P0.05)。下表同。2.1.2 SI 对奶牛肠系淋巴结淋巴细胞细胞因子浓度的影响由
11、表3可见，不同浓度的SI和不同的共育时间对肠系淋巴结淋巴细胞分泌IFN-的影响都存在着显著性差异。SI与肠系淋巴结淋巴细胞共育4h后，与对照组相比各浓度组均能提高IFN-水平，其中5.00、25.00 和100.00g/mL 组IFN-浓度分别为25.46、31.4和42.85pg/mL，与对照组（20.95pg/mL）相比均为显著（P0.05） 。24 h后，100.00和0.25g/mL 浓度组分别显著高于5.00g/mL组或极显著（ P0.05） 。24 h后，100.00和25.00g/mL浓度组均高于其余各组，也显著（P0.05 ） 。24 h后，0.25、1.00、5.00和100
12、.00g/mL浓度组均显著（P0.05） 。48 h后，除0.25g/mL添加组对IL-4 水平具有显著（P0.05） 。共育48h后，除0.25g/mL浓度组有下调 ER-mRNA表达的趋势外（差异不显著，P0.05） ，其余各组均有上调作用，但差异均不显著（P0.05） 。表7表明，各SI添加组均能显著（P0.05）或极显著（P0.01）提高奶牛肠系膜淋巴结中淋巴细胞ER-mRNA 的表达，与脾脏中淋巴细胞基本一致，均存在着正比的剂量关系。M.DNA 分子质量标准 DNA marker，1.雌激素受体 ER-,2.肌动蛋白 -actin，3.阴性对照 Negative control图 1
13、 目的基因的 PCR 产物表 6 SI 与脾脏淋巴细胞共育培养后 ER- mRNA 表达变化的实时定量分析4 h 24 h 48 hSI 添加水平CT F 值 F- CT F 值 F- CT F 值 F-M 1 2244bp341bp2000bp750bp250bpvalue value value对照组 9.730.57Aa 1.00 9.570.67Aa 1.00 8.680.42ABa 1.000.25g/mL 8.950.53ABa 1.72 9.400.4Aa 1.13 9.680.93Aa 0.501.00 g/mL 8.790.41Ba 1.93 9.420.42Aa 1.11
14、8.060.21Bb 1.535.00 g/mL 7.910.41Cb 3.53 9.370.65Aa 1.15 7.550.46Bb 2.1925.00 g/mL 6.830.46Db 7.51 8.440.51Ba 2.19 7.720.74Bab 1.94100.00 g/mL 5.550.46Eb 18.17 6.900.21Ca 6.38 7.700.57Ba 1.97表 7 SI 与肠系淋巴结淋巴细胞共育培养后 ER- mRNA 表达变化的实时定量分析 作用 4 h 后 作用 24 h 后 作用 48 h 后SI 添加水平CT F 值 CT F 值 CT F 值对照组 7.580.
15、44Ab 1.00 10.000.47Aa 1.00 9.960.92Aa 1.000.25 g/mL 6.800.72ABb 1.71 10.180.57Aa 0.88 10.650.26Aa 0.621.00 g/mL 6.890.57ABb 1.61 9.311.01Aa 1.62 10.010.64Aa 0.975.00 g/mL 6.550.36ABCb 2.04 6.090.45Bb 15.07 9.690.66Aa 1.2125.00 g/mL 5.720.82BCb 3.63 5.950.68Bab 16.62 7.651.03Ba 4.95100.00 g/mL 5.300.96Ca 4.86 4.950.78Ba 33.28 5.000.51Ca 31.223 讨论动物机体的免疫机能由细胞免疫和体液免疫2部分组成，细胞免疫功能的高低与T淋巴细胞的数量和活性有着密切的关系。辅助性T淋巴细胞（Th） ，依据其细胞因子分泌模式的不同分为Th1和Th2 2个主要功能亚群。Th1细胞分泌IL-2、 IFN-等Th1类细胞因子，诱发巨噬细胞活化和迟发超敏反应，参与细胞免疫的调节。Th2细胞主要分泌IL-4，IL-10 等Th2类细胞因子，诱发肥大细胞和嗜酸性粒细胞（Eos）生长、分化，参与体液免疫的调节 11。雌激素能提高由ConA诱导的卵巢去除
