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1、毕 业 论 文题 目: 绿茶中蛋白质及黄酮的抗氧化性初步研究 学院(直属系 ): 生物工程学院 年 级 、 专 业: 2008 级食品科学与工程 学 生 姓 名: 学 号: 指 导 教 师: 完 成 时 间: 2012 年 5 月 17 日 1目 录摘 要 .2Abstract.31 前言 .41.1 茶叶的主要功效 .41.2 茶叶内所含成分及其保健功效 .61.3 绿茶中抗氧化性蛋白质以及黄酮在食品中的应用 .71.4 绿茶中抗氧化性蛋白质以及黄酮在药品中的应用 .81.5 邻苯三酚自氧化法 .81.6 绿茶中抗氧化蛋白与黄酮的研究展望 .82 材料和方法 .92.1 材料和仪器 .92.
2、2 实验方法 .93 结果与讨论 .123.1 蛋白质的提取与分离 .123.2 抗氧化性结果分析 .134 结论与讨论 .364.1 结论 .364.2 讨论 .36总结与体会 .38致谢词 .39参考文献 .4022 材料和方法2.1 材料和仪器2.1.1 原材料绿茶：蒙山炒青（品名） ，四川省茗山茶业有限公司，市售。2.1.2 试剂硫酸铵：分析纯，成都市科龙化工试剂厂95%乙醇：分析纯，成都市科龙化工试剂厂磷酸盐缓冲液（干粉包）：分析纯，成都市科龙化工试剂厂碳酸氢钠：分析纯，成都市科龙化工试剂厂乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：分析纯，成都市科龙化工试剂厂焦性没食子酸（邻苯三酚）：分析纯，成
3、都市科龙化工试剂厂三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱）：分析纯，成都市科龙化工试剂厂盐酸：分析纯，成都市科龙化工试剂厂抗坏血酸：分析纯，成都市科龙化工试剂厂2.1.3 仪器电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9075A 型 上海一恒科技有限公司电子天平 TWX 型 北京赛罗利斯天平有限公司万用电炉 DL-1 型 北京中兴伟业仪器有限公司高速冷冻离心机 Centrifuge 5810R 型 德国 Eppendorf 公司恒温水浴锅 HH-2 型 常州国华电器有限公司磁力搅拌器 85-2C 型 郑州市亚荣仪器有限公司酸度计 pHS-3C 成都世纪方舟科技有限公司紫外可见分光光度计 UV-2100 型 北京瑞利
4、分析仪器公司2.2 实验方法2.2.1 蛋白质以及黄酮的提取和纯化2.2.1.1 蛋白质提取分离工艺流程绿茶浸提过滤离心上清液盐析离心上清液盐析离心沉淀透析 沉淀透析待测样品1 待测样品232.2.1.2 浸提液的制备准确称取50.00g绿茶，按绿茶(g)：磷酸盐缓冲液(ml)=1：10比例加入500ml磷酸盐缓冲液，充分搅拌后于4冰箱中静置过夜。取出后先将混合液用纱布过滤，然后把过滤夜置于离心管，等质量对称放置在冷冻离心机，以4，8000r/min速度离心20min ，取得上清液350ml 。2.2.1.3 盐析及透析脱盐查阅硫酸铵饱和浓度常用表，可知每100mL溶液配成40%饱和度溶液需加
5、固体硫酸铵22.6g。因此准确称取79.1g硫酸铵粉末，将制得的上清液置于500ml烧杯，将烧杯放在磁力搅拌器上，一边搅拌，一边在冰水浴中缓慢加入已经称好的硫酸铵粉末，控制好加入的速度，从而制成40%饱和度的硫酸铵溶液。等硫酸铵充分溶解后，将溶液置于4冰箱静置过夜。将上述溶液取出倒入离心管，注意等质量对称的放置在冷冻离心机中，以4，8000r/min速度离心20min ，取得上清液330ml ，下层沉淀为在40%(NH 4)2SO4离子浓度下析出的蛋白质。通过查阅硫酸铵饱和浓度常用表，每100mL溶液从40% 饱和度配置成 80%饱和度溶液需加固体硫酸铵25.8g。准确称取77.4g硫酸铵粉末
6、。将上清液置于500mL烧杯，在磁力搅拌器上，一边搅拌，一边在冰水浴中缓慢加入已经称好的硫酸铵粉末注意加入的速度从而制成80%饱和度的硫酸铵溶液。待硫酸铵充分溶解后，将溶液置于4冰箱静置过夜。然后将在40%(NH4)2SO4离子浓度下析出的蛋白质溶解于pH=6.8磷酸盐缓冲液中，而后置于截留分子质量为3000D的透析袋中，并用透析夹夹好，对其检查无漏液后，将透析袋中的蛋白质在4pH=6.8磷酸盐缓冲液中透析6h，然后再将透析袋更换入新的透析液中透析12h。待透析结束后将透析袋中液体置于试管中，放入4冰箱中保存备用。将配得的80%饱和度硫酸铵的样品液倒入离心管，注意等质量对称的放置在冷冻离心机，
7、以4，8000r/min 速度离心20min，获得的下层沉淀即为在80%(NH4)2SO4离子浓度下盐析出的蛋白质。所得的沉淀同样用pH=6.8磷酸盐缓冲液溶解并置于截留分子质量为3000D的透析袋中，在4条件下透析6h，然后再将透析袋转入新的透析液中透析12h。待透析结束后同样将透析袋中液体置于试管中，放入4冰箱中保存备用。4透析袋预处理过程：将透析袋用60%乙醇浸泡0.5h，再用蒸馏水洗净。再用10mmol/LNaHCO3和1mmol/L的EDTA 溶液煮沸10min ，然后用蒸馏水洗净，并检查是否漏水，确定不漏水后即可装入样品液透析。2.2.2.1 黄酮的提取工艺流程绿茶浸提过滤离心萃取
8、分液真空干燥待测样品2.2.2.2 浸提液的制备 准确称取50.00g绿茶，按绿茶(g)：蒸馏水(ml)=1：10比例加入500ml蒸馏水，充分搅拌后于4冰箱中静置过夜。取出后先将混合液用纱布过滤，然后把过滤夜置于离心管，等质量对称放置在冷冻离心机，以4，8000r/min速度离心20min ，取得上清液340ml 。2.2.2.3 溶剂萃取取得的上清液与正丁醇按1：1的比例混合后放入分液漏斗中萃取，萃取中注意混合均匀，然后静置待出现明显分层后弃去水相，收集正丁醇层，然后在真空干燥箱中干燥8小时后，得到分离纯化的绿茶黄酮类物质。黄酮样品用蒸馏水溶解，置于试管4保存待用。2.2.2.4 黄酮的测定：分光光度法2.2.2.4.1 标准曲线的绘制准确称取128mg芦丁标准品放到小烧杯中并加入少量纯水，水浴加热使其部分溶解，然后将溶液转移人100mL容量瓶中。剩余的在小烧杯中的固体继续加水溶解，一并转移到容量瓶中。按此步骤重复，直至所有芦丁均转移至容量瓶中
