《毕业论文-出芽短梗霉的诱变选育及丙二酸抗性筛选聚苹果酸高产菌》由会员分享，可在线阅读，更多相关《毕业论文-出芽短梗霉的诱变选育及丙二酸抗性筛选聚苹果酸高产菌（20页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、0出芽短梗霉的诱变选育及丙二酸抗性筛选聚苹果酸高产菌摘要：目的：以出芽短梗霉（A.pullulans ） AH2 为出发菌株，经紫外诱变和丙二酸抗性筛选获得聚苹果酸高产菌株。方法：以 AH2 为起始菌种，经制霉菌素预处理，改变了出芽短梗霉细胞膜的通透性，再经紫外线诱变后进行丙二酸抗性筛选，然后经溴钾酚绿初筛，根据筛选培养基上的菌落形态特征以及 HC 值的大小，选出用于发酵的菌株，最后对发酵产生的聚苹果酸进行定量测定，筛选获得 PMA 高产菌株。结果：最终获得一株出芽短梗霉高产菌株丙 5-5-4，其摇瓶发酵产量达到了 20.80g/L，比出发菌株提高了 6%,且高产特性稳定。结论：对丙二酸耐受的
2、出芽短梗霉菌株可以高产聚苹果酸，此种选育方法克服了随机筛选的盲目性，提高了菌种筛选的效率。关键词：聚苹果酸；PMA 高产菌株；溴钾酚绿初筛；紫外诱变；丙二酸抗性筛选；出芽短梗霉Screening of high poly malic acid mutant of Aureobasidium pullulans against malonic acid of Succinodehydrogenase InhibitorAbstract ：Objective Starting from the AH2, by mutagenesis and screening to obtain poly mal
3、ic acid production by Aureobasidium pullulans strains. Methods Taking AH2 as the starting strain, through nystatin pretreatment, changed by Aureobasidium cell membrane permeability, after UV mutagenesis of malonic acid resistance screening, and then by potassium and bromine phenol first green screen
4、, according to the selection of culture based on the morphological characteristics of the colony and the HC value, select strains for fermentation. At the end of fermentation to produce poly malic acid was quantitatively determined and screened to obtain high-yield strains of PMA.Results Finally, a
5、poly malic acid high yield strain 5-5-4 was obtained, its shake flask fermentation production reached 20.80g/L and the yield was increased by 6% compared with the starting strain AH2, and the yield was stable.Conclusion Aureobasidium pullulans of malonic acid tolerance can produce higher yield of po
6、ly malic acid by fermentation.This method overcame the blindness of random screening, and improve the 1efficiency of screening.Key words：Poly malic acid; PMA strain; potassium bromide phenol green screening; UV mutagenesis; screening of malonic acid resistance; Aureobasidium pullulans第 1 章 前言1.1 出芽短
7、梗霉出芽短梗霉（Aureobacidium pullulans）又称为“出芽苗霉” 、 “黑酵母”及“短梗霉”等，是一种半知菌类短梗霉，是类酵母真菌，它归属于半知菌门、丛梗孢目、短梗霉菌属具有酵母样和真菌菌丝体两种形态，这两种菌体形态受培养基成分、培养条件等因素的影响，是可以相互转变的。它在遗传上具有不稳定性，可以形成很多种变种，菌落最初有粘獨状，呈脏白色，很快转变为黄色，之后变为深绿色，最后为黑色，菌落边缘呈现辖射状，菌落的质地开始较为粘稠，最后变得坚硬 1。出芽短梗霉能产生很多种代谢产物，比如胞外多聚糖、酶类、抗菌素、聚苹果酸等。1.2 聚苹果酸的性质、结构、作用聚苹果酸( Poly-ma
8、lic acid，PMA) 是一种可完全生物降解且拥有高度生物相容性的水溶性高分子聚酯，PMA 具有良好的水溶性、易代谢性、可化学衍生性和生物安全性等特点而受到研究者的重视。2聚苹果酸有 、 等 3 种结构，其中 -PMA 在自然界广泛存在，用途也最为广泛，微生物发酵所得均为 型 2。苹果酸和聚苹果酸的结构如图 1所示 3。图 1 苹果酸与 3 种聚苹果酸的结构Fig.1 Structure of malic acid and poly (malic acid)s聚苹果酸可降解生成苹果酸单体,其中 L-苹果酸是生物体内三羧酸循环(TCA)的中间体,可参与代谢活动而被生物体吸收。此外,对聚苹果酸
9、的侧链-COOH 进行修饰或改性,引入功能基团或药物分子,从而提高药效和降低毒性。聚苹果酸的诸多优点,使其在药物载体和生物材料等领域获得重要的应用,在诸如手术缝合线、药物控制释放体系、组织工程支架材料及食品包装材料等方面有着广阔的应用前景 4。1.3 聚苹果酸的合成现状聚苹果酸的生产方法主要分为微生物发酵法与化学合成法，化学合成法多以 -烷氧羰基 -丙内酯为单体，在引发剂的条件下，通过开环聚合得到，成本相对较高 5。化学合成法得到的产物分子量低,约为 24kDa,不具备实际的应用价值；且催化剂有毒性,副产物较多,产物分离较困难并且合成步骤冗长,提纯工艺复杂,收率低(20),合成成本很高,严重制
10、约了其规模化生产。与化学合成法相比,生物合成法得到的 -聚苹果酸分子量高,可达 200760kDa；所需的原料简单易得,反应条件温和,产物较纯,近年来受到普遍的重视；但目前存在聚苹果酸的发酵产量低的缺点,距离聚苹果酸工业化生产的要求还有较大差距。现知能合成 PMA 的菌株主要有：短梗霉（ Aureobasidium sp） 、黏菌（ Physarum polycephalum ）和出芽短梗（ Aureobasidium pullulans） 6。3而有研究者表明短梗霉菌生产 PMA 的能力较强 7。目前普遍认为微生物发酵积累 PMA 是以 L-苹果酸为前体。刘双江等 8提出 Aureobasi
11、dium pullulans 合成 PMA 的途径与多头绒泡菌 Physarum polycephalum 相似，在两种真菌中，PMA 通过三羧酸循环和乙醛酸途径合成，其中乙醛酸途径作为 PMA 合成的替代途径。程若东等 9通过添加代谢抑制剂推断出芽短梗霉积累 PMA 与 TCA 循环和乙醛酸途径有关。近年来，相关研究者主要研究聚苹果酸产生菌出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)生物合成聚苹果酸的基本规律,重点研究生物合成中存在的关键问题如高产菌株的选育、发酵动力学及聚苹果酸合成代谢途径等,以提高聚苹果酸的产量,相关的工作具有重要的科学意义和研究价值,可为实现生物合成聚苹
12、果酸的产业化提供理论依据和技术支持。本文主要是通过琥珀酸脱氢酶抑制剂丙二酸结合紫外诱变选育聚苹果酸高产菌株。1.4 出芽短梗霉菌种的选育针对我国聚苹果酸不能形成工业化问题，出芽短梗霉的菌种选育主要希望能得到产酸量较高的菌株。基因突变是诱变育种的理论基础，而基因突变主要是碱基点突变和染色体畸变这两大类。诱变育种是用物理因素、化学试剂处理动植物或微生物细胞，使其基因突变的频率提高，然后选择适当的方法从变异群体中选择符合人们要求的单株个体，进而培养成新品种的方法。诱变育种是在杂交育种之后发展起来的一种新方法。物理诱变剂主要有紫外线，射线，射线，快中子，激光，微波，离子束等。其中紫外线是一种非电离辐射
13、，具有很好的诱变效果，而且使用使用紫外诱变的特点是比较方便和安全。碱基对紫外波段的光都具有很强的吸收能力，而其吸收高峰值为 260nm。在紫外照射过程中，分子大量并强烈的吸收紫外线，形成嘧啶二聚体，也就是两个相邻的嘧啶进行共价连接，进而形成嘧啶二聚体，嘧啶二聚体的形成致使氢键作用减弱，同时使双链结构发生扭曲，导致碱基之间无法形成正常配对，从而有可能引起突变，甚至死亡。另外二聚体的形成，使双链无法正常解开，因而引起复制和转录的异常。总之紫外线处理后可以引起碱基的缺失、移码突变、颠换或转换 10。因此，本文主要是对出芽短梗霉进行紫外诱变，另加筛选压力丙二酸，选育4聚苹果酸高产菌株。第 2 章 正文
14、材料与方法2.1 仪器与材料2.1.1 实验菌株 实验所用菌株为出芽短梗霉 AH2 突变株（诱变剂：ARTP 等离子） ，由本实验室经在平板上划线冷冻于冰箱。2.1.2 培养基1. 种子培养基：（100mL）用于出芽短梗霉的接种培养葡萄糖 6g ，硝酸铵 0.2g ，硫酸锌 0.01g ，硫酸镁 0.01g ，氯化钾 0.05g ，玉米浆 0.1g ，磷酸二氢钾 0.01g 。115灭菌 30 min。2. YPD 培养基：（100mL）用于菌株的活化葡萄糖 2g ，酵母粉 1g ，琼脂 2g，蛋白胨 2g。115灭菌 30 min 。3. 发酵前种子培养基：（100mL）用于菌株发酵前培养葡
15、萄糖 6g ，硝酸铵 0.2g ，硫酸锌 0.01g ，硫酸镁 0.01g ，氯化钾 0.05g ，玉米浆 0.1g ，磷酸二氢钾 0.01g 。以上成分混合调 PH5.7 后，加入碳酸钙0.6g/瓶(按每瓶加 30mL 培养基计算） ，在 115灭菌 30 min。4.发酵培养基：（100mL）5用于菌株发酵葡萄糖 9g ，硝酸铵 0.2g ，硫酸锌 0.01g ，硫酸镁 0.01g ，氯化钾 0.05g ，玉米浆 0.05g ，磷酸二氢钾 0.01g ，柠檬酸 0.1g 。以上成分混合调PH4.0 后，加入碳酸钙 0.9g/瓶(按每瓶加 30mL 培养基计算） ，在 115灭菌 30 mi
16、n。5.初筛培养基(0.02%溴甲酚绿培养基，100mL）：用于初步筛选出产聚苹果酸量大的菌株葡萄糖 3g ，硝酸铵 0.2g ，磷酸二氢钾 0.01g ，氯化钾 0.05g ，硫酸镁 0.02g ，琼脂 2g 。115灭菌 30 min 。溴甲酚绿溶液（0.01g/mL）单独灭菌，灭菌后按 0.02%加入三角瓶中。2.1.3 试剂葡萄糖，硝酸铵（重庆吉元化学有限公司） ，硫酸锌(重庆博艺化学试剂厂),硫酸镁（成都科龙化工试剂厂） ，氯化钾（成都科龙化工试剂厂） ，玉米浆 ，磷酸二氢钾（成都科龙化工试剂厂） ，蛋白胨（生物制药股份有限公司） ，琼脂粉（成都科龙化工试剂厂）,碳酸钙，柠檬酸 ，溴甲酚绿 (成都科龙化工试剂厂)，制霉菌素。2.1.4 溶液丙二酸溶液 0.05g/mL 溴甲酚绿溶液 0.01g/mL2.1.5 仪器及设备1.电子分析天平 JA003A2.T8 新世纪型紫外可见分光光度计 购于北京普析通用仪器有限责任公司3.D
