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1、1强直性脊柱炎与 HLA B2704, 05 亚型分布关系【摘要】目的：用流式芯片以及 PCR 技术检测 HLAB2704,05 亚型，提供临床诊断强直性脊柱炎的新方法.方法：对 124 例强直性脊柱炎患者及 50 例正常人采用流式细胞方法检测 HLAB27，采用流式芯片方法检测 HLAB27 亚型. 结果：124 例强直性脊柱炎患者HLAB27 阳性数 116 例，阳性率 94%，其中 HLAB2704 亚型68 例，占总阳性数的 58.6%，HLAB2705 亚型 48 例，占总阳性数的 41.4%.50 例正常人的亚型检测结果均为 HLAB2704 阳性. 结论：强直性脊柱炎患者的发病机
2、制与各亚型的特异序列无关，仅与HLAB27 各亚型共有序例有关，流式芯片技术可以快速准确地对HLAB27 相关亚型作出分析，为深入探讨强直性脊柱炎发病机制奠定工作基础，并提供强直性脊柱炎临床诊断的新方法. 【关键词】背柱炎强直性 HLAB27 抗原流式芯片 0 引言 强直性脊柱炎(AnkylosingSpondylitis,AS)是一种原因不明的以中轴关节慢性炎症为主要表现的全身性疾病，主要侵犯骶髂关节、髋关节、脊柱旁软组织及外周关节等.该病早期进展较慢，但后期发展较快，很短时间内形成驼背畸形，髋、膝等关节强直，待诊断明确时再予以正确治疗效果较差，故早期诊断尤为重要.HLAB27 分子由 2
3、条多肽链组成，一条 链或重链，Mr 约 44000.它们与另一条 链或轻链即 2 微球蛋白 (Mr 约 12000)结合共同组成 B27 分子21. 迄今已检出 25 个 HLAB27 等位基因 (亚型).可编码 23 种蛋白质(B2701B2723) 2.随着 HLA 基因分型性技术的成熟和发展，从亚型水平探讨 AS 的发病机制已成为可能.我们采用的流式芯片技术是近年来新发展的分子生物学研究方法，可以快速准确地对HLAB27 的相关亚型进行快速准确的检测，可以进一步深入探讨AS 的发病机制，提供临床上早期诊断 AS 的新方法. 1 材料和方法 1.1 材料研究样本为 2003/2005 年苏
4、北人民医院骨科门诊或病房AS 患者(按 1997 年 Englemen 提出的诊断标准 3)外周血，共124（男 88，女 36）例，全部为汉族，年龄分布为 1754 岁，另有 50 例正常人门诊样本.流式细胞仪 FACSCalibur 及所用HLAB27 检测试剂盒均为 BD 公司产品,Caliper1000 微流芯片分析仪来自德国安捷伦公司. 1.2 方法 1.2.1 流式细胞方法检测 HLAB27 取专用试管 1 支，加入mAb30L，再加入肝素 50L 抗凝血，充分混匀后置暗处于l5%22 20rain.荧光染色后，加入溶血剂 2mL，充分混匀，准确放置暗处 10min.以 1500r
5、/min 离心 5min.弃上清，用 PBS 洗涤 1 次，加入 PBS 液 0.5mL，混匀，上流式细胞仪分析. 1.2.2 流式芯片方法检测 HLAB27 亚型 1.2.2.1 引物设计 HLAB27 亚型引物序列为：上游5CCACTCCATGAGGTATTTCC3，下游35GTCTGTGCCTTGGCCTTGC3（由上海捷倍恩基因公司合成）. 1.2.2.2 基因组 DNA 提取抽取静脉血 0.5mL，EDTA 抗凝，盐析法提取 DNA，并用紫外分光光度计读取 260nm,280nm 两个波长下的吸光度检测 DNA 浓度. 1.2.2.3PCR 反应 PCR 反应体系中含 0.2mmol
6、/LdATP 双侧引物各 0.5mol/L，DNA 模板 0.1g，TaqDNA 多聚酶 11.5U，总体积 50L，PCR 反应在全自动 PCR 仪上进行，9630s 变性，6550s 退火，701min 延伸，30 个循环，72延伸 5min. 1.2.2.4 流式芯片确定 HLAB27 亚型扩增产物混匀，取 1L 加入芯片样品孔中，再加入染色胶，将芯片平稳置于 Caliper1000 微流芯片分析仪上，应用分析软件读取 HLAB27 各亚型峰图形. 统计学分析：AS 患者和正常人两组间的阳性率比较采用 2 检验. 2 结果 2.1HLAB27 采用流式细胞技术共检测 AS 患者外周血 1
7、24 例，结果阳性 116（男 94，女 22）例.另外还检测正常人外周血 50 例，仅发现 HLAB27 阳性 1 例. 2.2HLAB27 亚型对所有 HLAB27 阳性样本应用流式芯片技术，进一步确定 HLAB27 的亚型. 典型的 HLAB2704，05 亚型流式芯片检测结果见图 1A,B.在 124 例 AS 患者中：HLAB2704 亚型阳性68 人，占 HLAB27 阳性总数的 58.6%， HLAB2705 亚型阳性为48 人，占 HLAB27 阳性总数的 41.4%； 50 例正常人对照组中仅4有 1 例 HLAB27 阳性，且亚型检测结果为 HLAB2704.AS 患者组与
8、正常人对照组的 HLAB27 阳性率有显著性差异（93.5%vs0.5%,P0.05）. 3 讨论 HLAB27 是一种类组织相容复合体(MHC)基因即人类白细胞抗原基因,其表达产物即 HLAB27 抗原分子4.HLAB27是第一个被发现的人类某一疾病与一种 MHC 分子相关的抗原.1973由 Brewerton5 报道了 HLAB27 与 AS 的密切相关性，这在迄今已知的 HLA 与疾病的关联中是最强和最典型的.HLAB27 传统检测方法为免疫学和血清学技术(微量淋巴细胞毒试验)，现渐为流式细胞技术替代6.我们采用流式细胞技术对临床 AS 患者和正常人进行研究，所得结果也进一步验证上述这种
9、相关性，在所研究的124 例 AS 患者中，有 116 例 HLAB27 阳性，阳性率为93.5%，50 例正常人中有 1 例 HLAB27 阳性，阳性率为 0.5%.但是，因为普通人群 HLAB27 阳性率达 4%7%，而 AS 的患病率仅 0.3%左右 7 ，即 4070 名 HLAB27 阳性的个体中，只有 3名左右可能是 AS.AS 患者中，还有 10%左右 HLAB27 阴性.因此单凭 HLAB27 阳性不能确诊 AS，而 HLAB27 阴性也不能排除AS.因此进一步研究 AS 患者 HLAB27 的亚型分布具有十分重要的临床价值.随着 HLA 基因分型技术的成熟和发展，从亚型水平探
10、讨AS 的发病机制成为可能.目前的研究显示，不同亚型可表现出对 AS的正相关和负相关，所以在亚型水平上对疑为 AS 的患者作5HLAB27 检测，对 AS 的诊断和鉴别诊断具有重要价值8.目前检测 HLAB27 亚型的主要方法有 DNA 限制性片段长度多态性分析，PCR 单链构象多态性及 PCRDNA 测序等方法，这些方法通常是结果判读复杂，定量分析困难，不利于临床诊断上的推广普及.我们采用先进的流式芯片技术，可以快速准确地对 HLAB27 相关亚型作出分析，但由于抗体的交叉反应，有产生假阳性结果的可能9 ，我们在后面的分型实验中，由于采用灵敏度和特异性更高的PCR 加流式芯片方法，从而对第一
11、步的结果进一步加以确定，试验结果证明不存在假阳性.通常采用基因分型技术鉴定 HLAB 时，约有 1%的样本因 DNA 抽提失败而致假阴性10 . 我们在采用 PCR加流式芯片方法进行基因分型时，在扩增之前对所有样本 DNA 都进行了含量检测，避免了因 DNA 抽提失败而致的假阴性结果. 总之，本研究为分析 HLAB27 阳性 AS 患者的亚型分布关系提供临床资料，也为进一步深入探讨 AS 的发病机制以及与HLAB27 的确切关系奠定基础，并为临床 AS 疾病诊断提供辅助性的新方法. 【参考文献】 1ArchrJ,KeatA.Ankylosingspondylitis:Timetofocuson
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