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1、1巨细胞病毒抗原分支肽的合成与鉴定作者：杨赛，刘陶，杨浩，韩锋产， 陈五岭【关键词】 人巨细胞病毒Synthesis and identification of CMV branched peptide【Abstract】 AIM: To investigate the synthesis of human cytomegalovirus antigenic branched peptide. METHODS: The linear peptide and branched multiple peptide with human cytomegalovirus antigenic epitop
2、e were synthesized with solid phase chemistry respectively and purified by HPLC. The two peptides molecular masses were obtained by mass spectrum and then identified with quality control serums. RESULTS: The molecular mass of the linear peptide was 793.8 and that of branched multiple antigenic pepti
3、de was 7127.77, both consistent with the theoretic molecular mass. The branched peptide differentiated quality control serums properly through ELISA. CONCLUSION: The synthesis of cytomegalovirus antigenic branched peptide greatly facilitates the previous way for the preparation of 2human cytomegalov
4、irus antigen and has the advantage of low cost and no potential biohazard.【Keywords】 Solid phase synthesis; Human cytomegalovirus; Branched multiple antigenic peptide【摘要】 目的： 探讨人巨细胞病毒（ HCMV）抗原分支肽人工合成方法. 方法： 用固相合成方法分别合成 HCMV 抗原表位的线性多肽和分支多抗原肽，经 HPLC 进行纯化后质谱检验其分子质量，并用质控血清鉴定抗原活性. 结果： 合成的线性肽分子质量为 793.87
5、ku，八分支肽的分子质量为 7127.77 ku，均与其理论分子质量相符，分支肽经 ELISA 初步鉴定对质控血清具有较好的分辨效果. 结论： HCMV 抗原分支肽的人工合成大大简化了以往HCMV 抗原的制备方法，且制备成本低，无潜在生物危害.【关键词】 固相合成；人巨细胞病毒；分支多抗原肽0 引言人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）为已知最大的人疱疹病毒，能通过唾液、性接触、胎盘、哺乳、输血以及器官或干细胞移植等方式感染人类，引起多种疾病1，2 . 3HCMV 在发达国家的感染率约为 30%70%，在发展中国家则达到了 90以上3. 目前，诊断 HCMV 感
6、染的主要手段为血清学检测法，检测患者血清中抗 HCMV IgG， IgM. 我们根据Nejatollahi 等4以及 KyteDoolittle 亲水性方案预测 B 细胞表位结果，设计合成了含有 HCMV gp55 上的 VTSGSTKD （aa 798 to 805）抗原表位的八分支肽和线性肽，并用质控血清对肽的活性进行了初步鉴定. 1 材料和方法1.1 材料制备型 HPLC（Beckman 公司） ；C18 反相色谱柱（25 mm100 mm，15 m） （Waters 公司） ；核酸蛋白检测仪（上海嘉鹏科技有限公司） ；激光解析质谱（HEWLETT PACKARD 公司） ；台式冻干机（
7、军事医学科学院四环仪器厂） ； 固相萃取小柱（Waters 公司） ；芴甲氧羰基（Fmoc）保护的氨基酸（ Merck 公司）; 1 氧 3 双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐（ TBTU ） 、1 羟基苯并三氮唑（HOBT） （ABI 公司） ；线性多聚赖氨酸、DIEA、三氟乙酸（TFA） （Sigma 公司） ； G10，G25 凝胶（Pharmacia 公司） ；乙腈（Fisher 公司） ；ELISA 微孔板、小牛血清白蛋白（ BSA） 、羊抗人酶标抗体、邻苯二胺（OPD） （华美公司） ；ELISA 包被缓冲4液为 0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液（pH 9.6） ;洗涤液为含有 0
8、.5 mL/L Tween20 的 0.02 mol/L 的 PBS（pH 7.4） ；稀释液为含 50 mL/L小牛血清的 PBST20. HCMV 质控血清为第四军医大学全军基因诊断技术研究所提供.1.2 方法1.2.1 线性肽的合成将 PACPEGPS 树脂 0.5 g（替代度 0.2 mmol/g）用 NN 二甲基甲酰胺（DMF）浸泡 30 min 进行活化. 采用对称酸酐法将已经活化的树脂进行第一个氨基酸的连接. 称取待连接的氨基酸 195 mg，加入 1.5 mL 二氯甲烷（ DCM）和 3 滴DMF 使之溶解，加入 1 mol/L 二环己基碳化二亚胺（DCC ）/N 甲基吡咯烷酮
9、（NMP）275 mL，磁力搅拌，室温下反应 15 min，反应完毕，过滤除去沉淀，蒸发掉过滤液中的溶剂，得到对称酐. 将得到的对称酐溶于最少量的 DMF 中（保证最大浓度） ，加入到活化的树脂中，摇动 1 min，然后加入 0.1 mol/L 4 二甲氨基吡啶（DMAP）/DMF 460 L，摇动反应 90 min，吹去反应液，用 10 mL DMF 洗涤 3 次，吹干. 其余 7 个氨基酸的连接采用原位活化法，将连接有第一个氨基酸的树脂放入反应瓶中，加入 300 mL/L 哌啶/DMF 溶液 50 mL反应 15 min，以脱去 FMOC 保护基团. 取 2.0 mmol 保护氨基酸，5用
10、 1 mol/L DIEA/DMF5 mL 溶解，加入 4.0 mmol TBTU 和 4.0 mmol HOBT（DMF 为溶剂） ，预反应 1520 min，然后和氨基酸树脂一起反应 2 h，吹去反应液， 50 mL DMF 冲洗 3 次，吹干.将已合成好连接有全部氨基酸序列的树脂放入裂解容器中. 按照TFA水 955(V/V)切割试剂，使用时按 25 mL 切割试剂与 1 g树脂反应的比例进行切割，反应时间为 2 h. 将反应液快速倒入 150 mL 乙醚中，收集沉淀，所用乙醚需预先放在低温冰箱中冷却. 将沉淀重新加蒸馏水溶解，再转移到冻干机中冻干. 1.2.2 线性肽的脱盐用 5 mL
11、 固相萃取小柱，先用蒸馏水、500 mL/L 甲醇、蒸馏水各 15 mL 进行平衡，每次上样 0.5 mL（12 g/L） ，用蒸馏水 15 mL 进行脱盐，按甲醇 水8515(V/V)的比例配置洗脱液，15 mL 洗脱液进行样品的洗脱，洗脱液冻干后得样品.1.2.3 在分支状多聚赖氨酸支架上用顺序法合成八分支肽将赖氨酸作为第一个氨基酸按 1.2.1 的方法进行连接. 每次均脱保护 15 min 以上，偶联 60 min. 连接 3 次，得到八分支多聚赖氨酸骨架，将此支架上的赖氨酸作为合成肽的 C 端第一个氨基酸，依次进行八肽的连接. 1.2.4 在分支状多聚赖氨酸支架上用片段合成法制备八分支
12、肽将分支状多聚赖氨酸做为第一个氨基酸，把已合成并纯化好的线性6肽作为待连接的氨基酸按照片断合成法连接到该支架上. 将 5.5 mg（ 0.007 mmol）线形肽和 5 mg （0.0007 mmol）线形多聚赖氨酸按照 101 的比例混合，加 PBS 缓冲液（pH 7.4）510 mL 溶解；加少量 20 g/L 戊二醛进行连接，每 10 min 加入 2 mL,加 34 次，中间要摇晃或者采用磁力搅拌，反应完毕将溶液过G25 凝胶柱子，收集，冻干，得到 3 mg 左右连接好的复合物 . 1.2.5 八分支肽的脱盐用 G25 凝胶 15 g，溶胀后装柱，装好后的柱子先用蒸馏水 50 mL 进
13、行平衡，每次上样 35 mL，蒸馏水进行洗脱，用核酸蛋白检测仪检测 220 nm 处紫外吸收，按峰收集组分，将第一个峰的组分收集，冻干，成为脱盐的样品，冻干后备用.1.2.6HPLC 纯化多肽用半制备 HPLC，洗脱系统为： A液： 50 mL/L 乙腈/H2O 溶液； B 液： 950 mL/L 乙腈/H2O溶液. 手动进样，每次 1 mL，流速 4 mL/min，线性梯度，45 min内. B 液从 50 mL/L 升到 500 mL/L，然后 5 min 内升到 950 mL/L，B 液做最后洗脱 . 220 nm 处检测紫外吸收，按峰收集组分，用于质谱检测. 将分子质量检测正确的组分收
14、集，冻干，成为需要的纯品，备用. 1.2.7 质谱检验多肽采用激光解析质谱鉴定多肽，数据分析软7件为 G2025A Software A.02.01，方法严格按照操作手册进行，检测合成多肽的分子质量. 1.2.8ELISA 法鉴定多肽抗原活性将合成的线性肽、分支肽稀释成 5 mg/L 后取 100 L 包被 ELISA 微孔板， 4过夜；以 100 mL/L 的 BSAPBS 缓冲液 37封闭 1 h；洗涤 3 次，每次 3 min；加入 20 倍稀释的质控血清，100 L/孔，37温育 1 h. 洗涤 3 次后加入酶标二抗，37温育 1 h；洗涤 3 次后加入 OPDH2O2 底物,37,
15、10 min 终止反应 . 在酶标仪上测 A490 nm 值. 2 结果2.1 多肽 HPLC 纯化结果合成的线性八肽的粗品经 HPLC 纯化后，已去除绝大部分的杂质（Fig 1）.2.2 多肽质谱检验结果实际合成的多肽分子质量为 793.87 ku，与理论分子质量 793.8 ku 相差无几. 与 Fig 1 进行比较，两个主峰出峰时间近似（Fig 2）. 由 Fig 3 中可以看出，实际测定的分子质量和合成多肽的理论分子质量 7130.77 ku 接近.2.3 多肽抗原活性鉴定结果单纯线性肽检测结果普遍偏低，对质控血清无分辨效果，八分支肽对 15 份阳性及 10 份阴性质控血8清检测结果良
16、好，其中弱阳性血清 A490 nm 均在 1.0 以上，大于阴性血清 A490 nm 的 2.1 倍，表示八分支肽对质控血清具有较好的分辨能力.3 讨论单一表位抗原肽特异性强，经抗原抗体结合实验可断定患者有无该种病毒的感染，但由于线性肽分子质量小，空间结构单一，包被 ELISA 微孔板后未表现出应有的抗原活性，造成在本次实验中A490 nm 值普遍偏低，因此既不适合做检测抗原用，也不适合于作为疫苗的免疫原来使用. 八分支肽具有以赖氨酸为核心的放射状分子肽，寡聚赖氨酸分子质量小，免疫原性弱，基本上无特异性免疫应答抗体，此结构在加强了抗原优势表位的肽链结构的特异性的同时还增大了抗原的分子质量，改善了线性肽的空间位阻影响，增加了活性位点，进而改善了其抗原抗体反应的活性，在疫苗开发和肿瘤免疫治疗上有着巨大的应用前景5,6 . 我们设计合成的 HCMV 八分支肽可为以后进一步人工合成 HCMV 肽疫苗打下基础.【参考
