《咪达唑仑对新生大鼠离体脊髓运动神经元的作用（学位论文-工学）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《咪达唑仑对新生大鼠离体脊髓运动神经元的作用（学位论文-工学）（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1咪达唑仑对新生大鼠离体脊髓运动神经元的作用 *宦才娟，汪萌芽 *（皖南医学院细胞电生理研究室，安徽 芜湖 241002）Effects of midazolam on motoneurons in neonatal rat spinal cord in vitroHUAN Cai-juan, WANG Meng-ya*Cell Electrophysiology Laboratory, Wannan Medical College, Wuhu, Anhui 241002, ChinaAbstract Objective: To observe the effects of midazolam
2、 on motoneurons (MNs) in neonatal rat spinal cord slices. Methods: The conventional intracellular recording techniques were used to observe the effects of midazolam at distinct concentration on MNs of spinal cord slices isolated from neonatal rats (814d old). Results: In the 5 MNs steadily recorded,
3、 not only a depolarization response of (18.210.8) mV with increase of membrane resistance was induced by perfusion of midazolam at 0.1-1.0 mmol/L for 15 min of each concentration ( , P0.05 or P0.01), but also amplitude of action potentials was decreased Sx(P0.05), and even action potentials were nul
4、lified in 2 MNs. In 4 MNs with dorsal rootlet stimulation-evoked excitatory postsynaptic potentials (DR-EPSPs), bath of midazolam (0.1-1.0 mmol/L) reversibly depressed DR-EPSPs in a concentration-dependent manner. Moreover, in 3 MNs with DR-EPSP followed by inhibitory postsynaptic potentials (DR-IPS
5、Ps), DR-EPSPs were inhibited and DR-IPSPs were enhanced by midazolam at low concentration, whereas both of them were nullified at high concentration. Conclusion: The findings suggest that midazolam may reversibly and concentration-dependently inhibit the MN excitability and its synaptic transmission
6、 from sensory inputs.Key words: spinal cord; motoneuron; synaptic transmission; midazolam; electrophysiology摘 要 目的: 观察咪达唑仑对新生大鼠离体脊髓运动神经元（ MN）的作用。方法: 采用常规细胞内记录技术，观察不同浓度的咪达唑仑对新生大鼠（814d）离体脊髓MN的作用。结果: 在5个记录稳定的MN，累积灌流0.1 1.0 mmol/L咪达唑仑各15 min，不仅产生可逆的、浓度依赖性去极化反应 (P0.05或P 0.01)，并伴有膜电阻的增大(P0.05)，而且抑制动作电位的幅度
7、和发放频率(P0.05)，且1.0 mmol/L的咪达唑仑在其中2个MN 完全取消动作电位的产生。在4个记录到背根刺激诱发出兴奋性突触后电位（DR-EPSP）的MN，0.1 1.0 mmol/L咪达唑仑累积灌流各15 min，亦呈现浓度依赖性抑制作用，其中0.1 mmol/L的咪达唑仑对DR-EPSP抑制性作用具有统计学意义 (n=3, P0.05)。而在记录到DR-EPSP合并有抑制性突触后电位（DR-IPSP ）的3个MN ，低浓度咪达唑仑抑制DR-EPSP而增大DR-IPSP，但高浓度亦完全取消DR-IPSP。结论: 咪达唑仑对脊髓运动神经元兴奋性及其外周传入性突触传递具有浓度依赖性抑制
8、作用。关键词 脊髓；运动神经元；突触传递；咪达唑仑；电生理学咪达唑仑(Midazolam)是当前临床使用的唯一水溶性苯二氮艹卓(BZ)类药,依剂量的不同而具有镇静、催眠、抗焦虑、抗惊厥、抗癫痫及中枢肌松等作用 1。咪达唑仑具有起效快、苏醒快,对呼吸和循环功能干扰少,安全有效等特点,是较理想的静脉麻醉药,有广泛的应用前景 2。尽管临床观察发现静脉注射咪达唑仑显示镇痛作用 3，但有关咪达唑仑镇痛作用中是否涉及对脊髓运动神经元（motoneuron, MN）的影响,目前国内外尚未见研究报道。本文应用细胞内记录技术,观察咪达唑仑对新生大鼠脊髓切片MN的作用。 1 材料与方法1.1 新生大鼠脊髓切片的制
9、备 取814 d龄新生SD大鼠(雌雄不拘，由南京青龙山动物养殖场提供),参照报道方法 4,经乙醚麻醉后行椎板切除术,分离出含腰骶膨大的脊髓节段后,将脊髓用胶水(crazy glue)固定在琼脂块上,再将琼脂块固定于振荡切片机(Vibratome)的冰浴载物浴碟内,用剃须刀片横向切取厚度为400500m的脊髓切片若干 ,在室温下置于用混合气体 (95O 2 +5CO 2)饱和的人工脑脊液(ACSF)中孵育、备用。在制备脊髓切片过程中，用04并经混合气体饱和的ACSF浸浴离体的脊髓节段，整个过程控制在15min以内。ACSF的成分为(mmol/L): NaC1 127.0, KC1 1.9, KH
10、2PO4 1.2, CaC12 2.4, MgSO47H2O 1.3, NaHCO3 26.0, GlucoseH2O 10.0, pH 7.4。基金项目：安徽省自然科学基金（090413084)作者简介：宦才娟（1981-） ，女， 2008 级硕士研究生， (电话) 13665533836，(电子邮箱)hcj520 ；汪萌芽，男，教授，博士，硕士生导师， *通讯作者（E-mail: ）21.2 新生大鼠脊髓 MN 的细胞内记录 新生大鼠脊髓切片于室温下孵育 4060 min 后，用吸管移入自制的全浸式记录浴槽，用上、下两个丝网相夹固定，持续灌流经混合气体饱和的 ACSF，浴槽中灌流液的温度
11、为室温(2225)。用 P-97 程控微电极拉制仪(Sutter Instrument Co., USA)拉制含纤维玻璃微电极，内充 3 mol/L 乙酸钾，固定于微操纵仪(MP-1 ，Narishige，Japan)上，将探头(headstage)上的银丝插入电极尾端内，用于胞内电流注入及电位记录。选用尖端阻抗为 70120 M的微电极，在体视显微镜下经微操纵仪对脊髓切片中腹角 MN 区域进行细胞穿刺。缓慢手动推进微电极，当微电极压在细胞膜上时，通过 Axoclamp-2B 微电极放大器(Axon Instrument Inc., USA)的附设遥控装置(Buzz) 进行触发，引发电极尖端的
12、电磁振荡可使微电极刺入细胞内。记录到的膜电位信号经微电极放大器用桥平衡模式进行放大，桥平衡模式可经同一电极同时进行膜电位记录和电流注入。放大的膜电位信号经Digidata 1200 接口(Axon Instrument Inc., USA)输入计算机，用 pClamp 7.0 软件(Axon Instruments Inc., USA)进行采样、记录并保存。1.3 电刺激方法 细胞内电流注射：在微机内由 pClamp 7.0 软件（Axon Instruments Inc., USA）程序设定，由微机触发，信号经 Digidata 1200 联机接口输入微电极放大器后，刺激电流由探头输出经微电
13、极注入细胞内。腹外侧索（VLF） 、背根（DR）及腹根（VR）电刺激：由三通道电刺激器(Nihon Kohden, Japan)产生的方波脉冲分别经刺激器中一个通道输出，经隔离器(Nihon Kohden, Japan)以恒压模式至同芯双极刺激电极(Frederick Haer & Co., USA)。刺激电极尖端放置到脊髓切片的腹外侧索区、背根和腹根残端上，用于激活下行、背根传入和腹根纤维。1.4 给药方法 咪达唑仑注射液(徐州恩华药业有限公司)，实验时临时用 ACSF 配制成所需浓度 0.1, 0.3, 1.0mmol/L，由恒流泵灌流给药，全程用混合气体饱和，灌流用药的前后条件（如灌流的
14、速度与温度等）保持一致。每种浓度灌流 15 min，最后用 ACSF 洗脱。1.5 分析方法 记录到的资料，用 pClamp 8.0 中的 Clampfit 8.1 软件（Axon Instruments Inc., USA）进行处理，数据分析用 Origin 5.0 软件。数据以 表示，统计学显著性检验采用配对 t 检验，P0.05Sx为有显著性意义。2 结果选取静息电位(resting potential，RP) 负于60 mV且动作电位有超射，记录稳定的细胞，通过加在腹根残端上的同芯双极刺激电极进行逆行激活鉴定，若记录到具有全或无特点的动作电位(逆行AP)或碰撞试验阳性，即鉴定为MN ，
15、并进行如下实验和分析。2.1咪达唑仑对MN电学特性的影响 在5个MN ,给于0.1 1.0 mmol/L 的咪达唑仑累积灌流每一浓度各15 min，观察用药前后膜电生理参数，结果见表1。可见咪达唑仑产生浓度依赖性去极化作用（配对 t测验，P0.05 或P0.01），在0.3 mmol/L浓度作用时斜率电阻的增大有显著性意义（n=5, P0.05），作用可逆。表 1 咪达唑仑对 MN 电生理参数的影响（ Sx， n=5）Tab 1 Effects of midazolam on electrophysiological properties of neonatal rat spinal cord
16、 MNs in vitro. ( Sx, n=5)Midazolam (mmol/L)Control(n=5) 0.1(n=4) 0.3(n=5) 1.0(n=2)RP (mV). 71.19.4 53.213.0* 47.810.7* 36.08.5Rm (M). 49.48.2 51.69.7 58.011.0* 61.02.5 (ms) 11.53.9 14.7 6.7 14.84.0 14.67.33Action potentialAmp (mV) 76.39.1 63.715.5 52.415.7 #TL (mV) 5312.3 40.711.3 35.31.9 #OS (mV) 14.67.4 27.27.0 # #Spike potential Amp (mV) 59.87.
