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1、1小牛椎体骨质疏松模型的快速建立作者：杨彬奎，雷伟，王军，李运明 【摘要 】 目的： 利用乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2 ）脱钙法快速建立牛椎体骨质疏松模型. 方法： 4 具新鲜小牛脊柱，每具选取第 613 节椎体，共 32 个椎体，采用随机区组设计方法，分成共 8 个区组；采用 4 种处理方法： A 处理组（EDTANa2脱钙 3 wk） ，B 处理组（EDTANa2 脱钙 2 wk） ，C 处理组（不使用 EDTANa2脱钙） ，D 处理组（EDTANa2 脱钙 4 wk）. 分别检测各组椎体骨密度(BMD)后，拧入相同规格的通用性脊柱内固定系统（UPASS）椎弓根螺钉，测试其最大轴向拔
2、出力（Fmax ）及能量吸收值，同时各组取少量松质骨制成组织切片. 结果： A，B ，D 处理组的 BMD 均值，Fmax 均值及能量吸收值均值都低于 C 处理组（P0.01） ，A，D 处理组的 BMD 均值，Fmax 均值及能量吸收值均值都低于 B 处理组（P0.05）. 切片显示 A，D 处理组骨小梁较 C 组骨小梁变细、数量轻度减少,间距增宽, 骨髓腔扩大. 结论： 应用 EDTANa2对牛椎体进行脱钙，可在较短的时间内建立用于生物力学研究的牛椎体骨质疏松模型. 2【关键词】 骨质疏松；疾病模型，动物；生物力学；EDTANa2；骨密度0 引言由于骨质疏松造成的椎弓根螺钉松动、拔出的情况
3、在临床工作中很常见，给脊柱外科手术带来了极大困难1. 如何提高椎弓根螺钉在骨质疏松患者的固定强度已成为国内外研究的热点. 本实验利用乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2 ）对新鲜小牛椎体进行脱钙处理，以期为相关研究建立一种简便、快捷的实验模型.1 材料和方法1.1 材料新鲜小牛脊柱 4 具，每具选取第 613 椎体，8 节共 32 个椎体，X 线和骨密度检查均无明显的骨质疏松、先天性畸形、骨折和肿瘤等病变；去除软组织，分解为单个椎体并保持每个椎体的完整性. EDTANa2，NaOH( 天津市化学试剂三厂)；椎弓根螺钉采用通用性脊柱内固定系统（universal poly axial spinal
4、system, UPASS）钉（6.5 mm40 mm） （山东威高骨科材料有限公司） ；双能 X 线吸收骨密度（bone mineral density, BMD）仪(美国Lunar Corp 公司) ；拉伸试验机(AGSJ, 日本岛津公司)；leicaLA全自动研究显微镜（德国莱卡公司）.31.2 方法1.2.1 实验分组采用随机区组的设计方法. 4 具新鲜小牛脊柱，每具选取第 613 节椎体共 8 节椎体，采用随机区组设计方法分成共 8 个区组；根据随机原则，分配至 4 个处理组：A 处理组（EDTANa2 脱钙 3 wk） ，B 处理组（EDTANa2 脱钙 2 wk） ，C 处理组（
5、不使用 EDTANa2脱钙） ，D 处理组（EDTANa2 脱钙4 wk）.1.2.2 标本脱钙处理所有椎体均用标准 4.0 mm 丝攻预制双侧椎弓根钉道，然后浸入 40 g/L 甲醛固定 6 h，再取出清水冲洗、浸泡 12 h. C 处理组不用 EDTANa2脱钙处理；A，B，D 处理组用0.595 mol/L 的 EDTANa2脱钙液 2400 mL（加入 NaOH 约0.713 mol/L 以调整 pH 值为 7.0)，分别浸泡 2，3 和 4 wk. 每日2 次用 20 mL 注射器将浸泡椎体的 0.595 mol/L EDTANa2脱钙液向每个椎弓根钉道内注射，每周更换 1 次脱钙液
6、（脱钙液的浓度和量均不变）.1.2.3 标本检测分别于 2，3 和 4 wk 后从脱钙液中取出A，B ，D 处理组，使用双能 X 线吸收 BMD 仪分别检测每个椎体的BMD；随后在每个椎体双侧拧入 UPASS 椎弓根螺钉，用超硬石膏4垂直包埋于特制钢制容器中，采用日本岛津 AGSJ系列拉伸试验机，以 5 mm/min 的速度轴向牵拉，直至螺钉被拉出，记录最大轴向拔出力(Fmax)及能量吸收值.1.2.4 组织切片观察 A，B ，C ，D 各组中分别取钉道周壁松质骨制作组织切片，leicaLA 显微镜下观察.统计学处理： 采用 SPSS13.0 统计软件分析. 不同处理组BMD 均值、Fmax
7、均值及能量吸收值均值均采用随机区组的方差分析及 Dunnettt检验进行比较，BMD 与 Fmax 作 Pearson 相关分析, Microsoft Office Excel 2003 软件制图表. P0.05 为差异具有统计学意义.2 结果2.1BMD, Fmax, 能量吸收值各处理组的 BMD，Fmax 和能量吸收值均值（表 1） . 通过随机区组的方差分析，结果显示，A，B ，D 处理组的 BMD 均值、Fmax 均值及能量吸收值均值都低于 C 处理组（P0.01） ，A，D 处理组的 BMD 均值、Fmax 均值及能量吸收值均值都低于 B 组（P0.05）.5表 1 各不同处理组的骨
8、密度（BMD） 、最大轴向拔出力(Fmax)和能量吸收值（略）bP0.01 vs C.2.2 脱钙时间对 BMD 和 Fmax 的影响脱钙的时间越长，BMD 越低（图 1） ；脱钙的时间越长，椎弓根螺钉的 Fmax 也越小（图 2）.图 1 骨密度 时间变化（略）图 2 最大轴向拔出力 时间变化（略）2.3BMD 和 Fmax 的相关性分析将 BMD 与 Fmax 进行相关性分析，Pearson 相关系数 r=0.884，P0.01，显示 BMD 与椎弓根螺钉的 Fmax 存在线性正相关（图 3）.2.4 组织切片观察组织切片结果显示,C 处理组（未脱钙组）骨组织中骨小梁丰富,相互交连成网状；
9、A 处理组（脱钙 3 wk）,D处理组（脱钙 4 wk）骨小梁与 C 处理组相比，骨小梁变细、数量减少, 相互联结分离,间距增宽, 骨髓腔扩大，但变化均匀，保持了松质骨正常的形态结构.6图 3 骨密度与椎弓根螺钉最大轴向拔出力的散点图（略）3 讨论近年来椎弓根螺钉固定技术已经广泛应用于治疗脊柱退行性病变，骨折，畸形等病症2-3 ，但是在骨质疏松的患者，椎弓根螺钉的松动、拔出的情况却很常见，并且随着人类寿命的延长和我国老龄化社会的到来，这一问题越来越突出. 为解决这一问题，国内外开展了大量的研究4 ，目前用于脊柱生物力学研究的骨质疏松动物模型是以去势雌性山羊为代表的动物模型5-8 ，但也存在下列
10、几点不足： 模型建立时间长：目前公认需 6 mo 左右； 建立过程繁琐且费用高：需先为羊做去势手术，术后还需行消炎等治疗；需饲养 6 mo 方能进行实验； 模型的可靠性差：季节、生育、营养状况、健康状况、接受光照情况等不确定因素都可以影响模型 BMD 的变化，导致模型的可靠性较差. 所以，建立一个快速、简便且满足脊柱生物力学研究需要的骨质疏松模型就显得非常必要.本实验中选用 EDTANa2作为脱钙剂，相对于 HCL 等其它脱钙剂，虽然脱钙速度慢，但有一个突出优点对细胞等微观结构的破坏要小的多；实验中加入 NaOH 以调整 pH 值为 7.0，也是防止 pH 值过低对椎体微观结构的破坏. 用 2
11、0 mL 注射器将浸泡椎体的脱钙液向每个椎弓根钉道内注射 2 次/d，能促使脱钙液更好的7进入椎体内部，起到更好的脱钙效果. 每周更换相同浓度和量的脱钙液 1 次，以保持相对恒定的脱钙液浓度，这样既加强了脱钙的效果，又排除了脱钙液浓度变化对脱钙效果的影响，以便更好的观察脱钙时间长短对 BMD 的影响.实验中采用每具小牛脊柱的第 613 节椎体共 8 节椎体，是由于这 8 节椎体的形态结构及大小很接近，且和人体的胸腰椎结构相似. 通过对实验结果的分析，发现随着脱钙时间的延长，BMD 明显下降，椎弓根螺钉的 Fmax 均值及能量吸收值均值也都明显下降. 目前临床上一般将 BMD 下降到相同人种、相
12、同性别年龄组人群BMD 均值 7587的患者诊断为骨量减少，BMD 低于 75的患者诊断为骨质疏松，BMD 低于 63的患者诊断为严重骨质疏松9-10. 采用这一标准，将 C 处理组与 A，B，D 处理组对照，均已满足建立动物椎体骨质疏松模型的要求. 通过对 BMD 与椎弓根螺钉 Fmax 进行相关性分析，得出 BMD 与 Fmax 存在正相关，也进一步证明了 BMD 的减低将直接影响椎弓根螺钉的固定强度.综上所述，用 0.595 mol/L 的 EDTANa2脱钙液（pH 7.0）对牛椎体进行脱钙处理，完全可以满足建立用于生物力学研究的牛椎体骨质疏松模型的需要，其优点： 快速、简便、费用低；
13、 可靠性好； 通过调整脱钙的时间，还可以调控模型的骨质疏松程度. 该模型作为离体模型，虽不能替代去势雌性山羊为代表的8活体动物模型，但可以快速、准确的为脊柱生物力学的实验研究提供验证数据，从而为进一步的活体动物实验可靠的依据.【参考文献】1 Okuyama K, Sato K, Abe E, et al. Stability of transpedicle screwing for the osteoporotic spine. An in vitro study of the mechanical stabilityJ . Spine, 1993, 18(15):2240-2245.2 Ga
14、ines, Robert WJR. The use of pedicleScrew internal fixation for the operative treatment of spinal disordersJ. J Bone Joint Surg, 2000，82(10):A1458-A1476.3 Deen HG, Birch BD, Robert E, et al. Lateral mass screwrod fixation of the cervical spine: A prospective clinical series with 1year followup J. Sp
15、ine,2003, 3(6):489-495.4 Sarzier JS, Evans AJ, Cahill DW, et al. Increased pedicle screw pullout strength with vertebroplasty augmentation in osteoporotic spinesJ. Neurosurgery, 2002,6(3 Suppl):309-312.95 Turner AS, Alvis M, Myers W, et al. Changes in bone mineral density and bonespecific alkaline phosphatase in ovariectomized ewesJ. Bone,1995，17 （4 Suppl）:S395-S402.6 Newman E, Turner AS, Wark JD. The potential of sheep for the study of osteopenia: Current status and comparison with other animal modelJ . Bone,1995,16(4）: S277-S284.7 李良，陈槐卿，陈孟诗，等. 建立骨质疏松山羊模型初探J. 中国骨质疏松杂志,1998,4(2) ：12-16.
