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1、1导向溶栓研究的某些进展 早期溶栓治疗，可以缩小心肌梗塞面积、维护左室功能、降低死亡率，因而成为急性心肌梗塞的标准疗法之一。然而当前应用的溶栓剂仍存在明显的缺陷，主要是特异性差，要达到完全溶解血栓的目的，常需较大剂量连续静脉给药，因而增加了全身纤维系统激活致出血的危险性。如何将栓剂特异性靶向到血栓部位，一者提高溶栓效力，二者降低全身出血等副反应，一直是该领域研究的热点，近年来，分子生物学技术的飞速发展，为解决溶栓导向性问题提供了很多有效途径，兹就这方面的研究进展作一简要综述。 1 靶向溶栓剂的构建 近年来，运用分子生物学理论和基因工程技术，对现有的溶栓剂分子进行重组和修饰，通过增加纤维蛋白结合
2、位点或将溶栓剂与特异性抗体连接，构建了很多新型的，特异的靶向溶栓剂。 1.1 t-PA/u-PA 杂合体： t-PA 和 u-PA 是两种主要的生理性纤溶酶原活化剂，均可通过裂解 Arg-Val 键而将纤溶酶原转变为2纤溶酶，但二者又有其各自的特点。 t-PA 具有对纤维蛋白特异性亲和作用，这是由于 t-PA 分子的环饼结构域（Kringlez ）带有一个赖氨酸结合位点（LBS） ，可介导与纤维蛋白结合；u-PA 对纤维蛋白没有特异性，但对纤溶酶原具有很强的专一催化作用。为了充分利用二者的长处，Agnelli 等1 构建了由来片 t-PA a 链及 u-PA 的丝氨酸蛋白酶部分组成的杂合体，动
3、物体内实验表明，其溶栓效力提高了 3-16 倍，循环半衰期延长 6-20 倍。但也有些类似的杂合体并显示出纤维蛋白特异性亲和性。Novokhatry 等2通过差异扫描测热法（differential scanning calorimetry）研究了这种杂合蛋白分子内结构域之间的相互作用，结果显示 t-PA 的 LBS 与来自 u-PA的 leu144-lys157 的残基结合，从而封闭了 LBS，使其与纤维蛋白的亲和性减弱。 1.2 特异性抗体靶向溶栓剂：利用单克降抗体与其相应抗原的高度特异性亲和作用来实现溶栓剂的靶向作用。一种方法是将抗体通过化学交联剂交联至溶栓剂分子上，但由于来源于动物的单
4、克隆抗体的异体成分会引起人体的免疫反应，故近来多应用基因工程技术将编码抗体结合位点和纤溶酶原激活剂催化位点的两种基因杂交后表达出融合蛋白，这样可以以人的免疫球蛋白代替大部分抗体的异体结构，减少免疫反应3。Holvoet 等4 应用基因重组技术构建了两个重组的杂合分子：K12G0S32 和 K12G2S32，前者是由3scu-PA 的低分子量衍生物（Ala132Leu441）与纤维蛋白片段D-二聚体特异性单克隆抗体的可变区片段 Fv 组成的杂合分子；后者是用 Glu 取体 Asn88，从而使 Fv 脱糖基化。体内外溶栓实验表明：K12G0S32 的溶栓效力较 rscu-PA 提高了 10 倍，而
5、K12G2S32 提高了 2 倍，但 K12G2S32 的血浆半衰期较 rscu-PA延长了 4 倍。提示这种杂合的抗体靶向性 PA 不仅可增加特异性溶栓效力，而且可减少清除率。 此外，大量研究证明，血管紧张素转移酶（ACE）的单克隆抗体静脉注射后能积聚在多种动物的肺部。Muzykanktor 等5根据一特性，使用 Streptavidin 作用交联剂，将 scu-PA、t-PA 及SK 分别与抗 ACE 单克隆抗体交联，动物体内实验表明，这些交联物对肺血管有特异靶向性，并且延长了在肺血管床滞留的时间，为肺栓塞的纤溶治疗提供了一个研究基础。 1.3 t-PA/P-selectin 融合蛋白：P
6、-selectin 是血管粘附蛋白选择素家族中的成员之一，是一种分子量为 140kD 的糖蛋白。P-selectin 主要存在于血小板的 a 颗粒及内皮细胞的 Weibel-Palade小体中，内皮细胞及血小板受环境刺激活化时，P-selectin 迅速转移到细胞表面，在血栓形成初期的白细胞贴壁流动中起着非常重要4的作用。P-selectin 的配基主要存在于白细胞，单核细胞及某些淋巴细胞表面。Fujise 等应用基因工程技术表达出含 t-PA 及 P-selectin 的融合蛋白，体内溶栓实验表明，该杂合分子具备与 t-PA一样的溶栓活性，而且保存了 P-selectin 配基结合的能力，提
7、示这种杂合蛋白可能提供一种靶向 t-PA 到血栓区域的有效方法。 1.4 rscu-PA/AV 杂合体：Annexin(AV)是从人胎盘中纯化 的一种抗凝蛋白，在 Ca2+的存在下，其对裸露在活化血小板膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度的亲和性，因而 AV 可作为一种靶向剂，将溶栓剂靶向到富含血小板的血栓。无论是应用化学方法构建的 AV 与 UD 交联物 7，还是应用基因重组技术获得的 rscu-PA/AV 杂合体8均获得了交叉分子的酶活性及膜结合活性，从而增加了对血栓的特异性，提高了溶栓效力。 1.5 t-PA 或 u-PA 突变体：Yamada 等通过在 t-PA 分子中引入 Arg-Gl
8、y-Asp(RGD)序列构建了几种突变体 t-PA。实验表明，这种突变体具有以 RGK 依赖的方式对血小板整合素（如 22）高度亲和的特性。同时仍保留了 t-PA 一样的纤溶活性，提示这种双功能分子可用作血小板血栓的特异性溶栓剂。董晨等10将人工合成的编码 GPRP 四肽的寡核苷酸序列连接至 scu-PA(144-411)克隆5脱氨核糖核酸（cDNA ）的 5端，并将其重组克隆到表达载体PKK233-2 中，在大肠杆菌中得到 5%的表达量。体外实验表明，这种突变体纤溶效率为 LUK 的 2-3 倍，对纤维蛋白的亲和性比 LUK提高了 6 倍，且对纤维蛋白原亲和力很强，提示 GPRP 四肽可提高
9、尿激酶对纤维蛋白的专一性。 构建具有趋血栓特异性的靶向溶栓剂是实验导向溶栓的一个主要途径，然而尽管应用基因工程技术构建了很多这类新型靶向溶栓剂，但其溶栓效力及血栓特异性作用仍达不到理想的程度，因而仍处在实验研究阶段，未能应用于临床。 2 脂质体靶向携载溶栓剂 脂质体是一种由磷脂双分子层组成的囊泡，由于其免疫原性低，体内易代谢，无毒副作用，因而可作为一种理想的药物载体。晚近，很多研究表明11 ，12 ，应用脂质体包裹 t-PA 或链激酶（SK） ，可大大降低出血等并发症，同时促进了 SK 被递送到血栓及其附近的浓度。应用的动物血栓模型观察表明，脂质体包裹 SK 恢复血管再通的时间只游离 SK 的
10、 50%。凌世长等 13应用 RGDS 多6肽修饰的脂质体包裹尿激酶（UK） ，利用 RGDS 与活化血小板表面的纤维蛋白原受体的特异性亲和作用，引导脂质体溶栓剂的靶向性溶栓效应。 脂质体靶向携载溶栓剂为实现导向溶栓提供了一种新的方法，但由于仍然存在很多问题未得到解决，如脂质体进入血液循环后，易被网状内皮系统清除，在血栓部位不易达到有效浓度；另外，如何控制脂质体在血栓部位释放溶栓剂，仍未能解决，因而限制了该技术的进一步应用。 3 导管导向溶栓： 对于有些血栓性疾病，如肺栓塞，静脉给药常难凑效。应用局部导管直接在血栓部位给药，可大大减低药物剂量，减轻副反应，同时达到快速、完全溶栓之目的14 ，1
11、5 。如 Beitzke 等通过局部导管给药治疗一例左肺动脉栓塞的 3 岁患儿，取得成功，血栓完全溶解，未出现任何副反应。对于急性心肌梗塞（AMI）患者应用溶栓治疗可使血管再通，降低死亡率。但大样本调查表明仍有 20%-35%的病例溶栓失败。而且还有 10%-15%的病人出现再梗塞。近7年来，主张对 AMI 应用经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）直接治疗。Grines 等16对比了 PTCA 溶栓治疗的效果，二者可获同样的治疗效果；使用 t-PA 治疗的病人 2%发生颅内出血，而 PTCA 组无事件发生。 应用局部导管直接给药或是经 PTCA 直接消除血栓是治疗血栓的最佳途径，但需要较高的技术
12、设备条件，而且对患者有一定创伤，不易普及开展。 4 基因定位转移 随着分子生物学理论与技术的日益发展，应用基因治疗某些疾病成为可能。Dichek 等17 在体外应用重组 t-PA 逆转录病毒载体，转染动脉和静脉的内皮细胞，并在 stent 和 Graft 膜上培养，培养后的内皮细胞再植入动脉内，其血中 t-PA 的浓度可升高 10-30倍，并持续 2-3 个月，可以有效防止实验性血栓形成与血管再狭窄。在此基础上，有些学者提出能否将 t-PA 或 prcu-PA 的 cDNA 定向转移到血栓部位，使其在该处表达溶栓剂，发挥直接溶栓作用，进而防止再梗塞。目前仍未见成功的报导，但无疑是今后研究的方向
13、。8参考文献 Agelli G,Pa scucci C,Nenci G,et al.Thrombolymic and haemorrhagic effects of bolus dosed of t-PA and a hybrid plasminogen activator with prologed plasma half life.Thromb Haemast,1993,70:294 Novokhatny V,Medved L,Lijnen R,et al.Tissue-type plasminogen activator (t-PA)interacts tieh urokinase-ty
14、pe plasmigen activator (u-PA) via t-PAs lysine binding site.J Biol Chem,1995,270:8680 Runge MS,Laruence AH,Christoph B,et al.Enhanced thrombolytic and antithrombotic potency of a fibrin-targeted plasminogen activator in baboons,Circulation,1996,94:1412 Holvoet P,Laroche Y,Stassen JM,et al.Pharmacoki
15、netic and 9thrombolytic properties of chimeric plasminogen activators consisting of a single-chain Fv fragment of a fibrin-specific antibody fused to sinlge-chain urodinasw.Blood,1993,81:696 Muzykantov VR,Barnathan ES,Atochina EN,et al.Targeting of antibody conjugated plasminogen activator to the pu
16、lmonary vasculatrue.J Pharmacol Exp Therapeut,1996,279:1026 Fujise,Kenichi,Revelle BM,et al.A tissue plasminogen activator /P-selection fusion protein is an effective thrombolytic agent.Circulation,1997,95:715 Tanaka K,Einaga KI,Tsuchiyama H,et al.Preparation and characterization of a disulfide-linked bioconjugate of annexin V with the B-chain of urokinase:An improved fibrinolytic agent targeted to phospholipid-containing t
