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1、关于雨生红球藻虾青素合成关键酶基因 bkt 分子机制相关研究曾志勇、袁家铮、吴美婷、宋雪1、立项依据与研究内容1项目的立项依据（1）研究目的与意义虾青素（astaxanthin,AST，3,3-二羟基 4 4-二酮基- 胡萝卜素,分子式为 C40H52O4）是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，可作为脂溶性的色素,具有艳丽的红色和强的抗氧化性能。在食品工业中,不仅能有效起到保鲜、保色、保味、保质等作用,而且能为多类食品着色,增加食品的色泽美感。另外,动物实验表明虾青素有抑制肿瘤发生、增强免疫功能等多方面的生理作用。因此虾青素还可以运用于保健品，以提高机体免疫能力和防癌抗癌为特点，运用于化妆品中
2、还具有抗氧化，防衰老，抑制色素累积等优点。此外，虾青素进入动物体后可以不经修饰或生化转化而直接贮存于组织中，使一些水生动物的皮肤和肌肉出现健康而鲜艳的颜色，因此虾青素是鱼类饲料中的首选色素，虾青素还可以促进生长繁殖及家禽的产蛋率。总之，虾青素具有巨大的市场潜力和广泛的应用价值和商业前景。研究表明，虾青素是具有抗氧化活性的类胡萝卜素，与 -胡萝卜素、维生素 E 等相比，虾青素具有更强的生物活性，是属于对人体安全无害的物质。虾青素的抗氧化活性比 -胡萝卜素高约 32 倍，比维生素 E 高约 100 倍，虾青素已被认为是“超级抗氧化剂”。目前国际市场的价格为每千克 100 美元，由于虾青素结构的特异
3、性让它具备多种效用价值，因此全球每年有 1 亿美元以上的市场容量。目前生产虾青素的方法有两种，包括化学合成和生物提取。由于化学合成的虾青素比之天然虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面都要略逊一筹，所以很多科研人员寻找高效的天然虾青素合成方法来弥补化学合成虾青素的不足。目前市场上虾青素的主要来源是雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）。这种藻是天然虾青素产量最高的生物，在特定条件下，雨生红球藻可以积累占其干重 1%3%以上的虾青素，且所含虾青素的结构与养殖对象所需一致，被公认为天然虾青素的最好生物来源。雨生红球藻是一种单细胞绿藻，在多种逆境胁迫条件下能够大量合成并迅速积累
4、的次生代谢产物虾青素。例如在强光、缺氮诱导或者 ABA 诱导等条件下，雨生红球藻合成虾青素。雨生红球藻虾青素的合成机制很特别，在弱光、氮磷丰富的环境中主要以绿色的游动细胞形式存在；而在不利于生存的条件(高光照、高温、高盐和营养盐饥饿)下则以不动细胞形式存在，并积累大量的类胡萝卜素，其中 80%以上是虾青素。雨生红球藻虾青素合成的触发明显与环境胁迫因子相关，是研究绿藻在环境胁迫下如何进行基因表达调控极佳的实验材料，具有重要的学术价值。有研究证明在诱导条件下雨生红球藻细胞内虾青素积累明显。在虾青素合成酶系基因中八氢番茄红素合成酶基因( psy)、八氢番茄红素脱氢酶基因 ( pds) 在诱导条件下，
5、mRNA 水平在一段时间内持续升高，在诱导后期 mRNA 依然保持较高水平。胡萝卜素羟化酶基因( crtR-B)、胡萝卜素酮化酶基因( bkt ) 在诱导一段时间后 mRNA 水平升高后又略有下降,而番茄红素环化酶基因 ( lcy) 则不受这些诱导条件的调控,一直处于较高水平的表达。虾青素合成基因表达模式的差异表明这些基因分子调控机制不尽相同。-胡萝卜素酮化酶 (BKT) 是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶，能够以 -胡萝卜素(-Carotene)和玉米黄素(Zeaxanthin )为底物，形成角黄质 (Canthanxanthin) 和虾青素。其中 -胡萝卜素酮化酶基因（bkt）的转录活性
6、与虾青素含量呈明显的线性关系，胁迫前，几乎检测不到任何 bkt 转录活性和虾青素；胁迫后，bkt 的转录活性最多上升近百倍，虾青素也相应得到大量积累。参 考 文 献陈兴才，黄伟光，欧阳琴. 雨生红球藻中虾青素酯的皂化及游离虾青素的纯化分离 . 福州大学学报. 2005, 33(2): 264-269张晓丽 1,2，刘建国 1,*. 虾青素的抗氧化性及其在营养和医药应用方面的研究. 食品科学.2006,27(01):258-262朱明军，宗敏华，吴振强，梁世中. 虾青素研究进展. 食品工业科技. 2000,21(2):79-81高桂玲，成家杨，马 炯 *.雨生红球藻和虾青素的研究.水产学报. 2
7、014,38(2):297-304章丽，龚一富 *，刘晓丹， 张文青. 盐生杜氏藻 -胡萝卜素羟化酶基因(chyb)的克隆及表达分析.农业生物技术学报. 2013, 21(8): 920-930梁成伟 1 , 2，田 李 2，苏忠亮 1，秦 松 2 . 诱导条件下雨生红球藻虾青素合成相关基因的表达特征分析.青岛科技大学学报（自然科学版）.2009,30(3):221-225檀琮萍 1,2，梁成伟 1,2，苏忠亮 3，秦松 1. 雨生红球藻 -胡萝卜素酮化酶基因克隆、分析 及叶绿体表达载体构建.海洋通报.2007.26(1):35-40檀琮萍 1,2，阎斌伦 3，梁成伟 1,2，苏忠亮 4，秦
8、松 1. 雨生红球藻 -胡萝卜素酮化酶基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达.海洋科学,2007,31(11):67-72滕长英 1，张 立 1，缪 静 1，秦 松 2. 雨生红球藻虾青素积累机制的研究进展 . 海洋科学. 2006, 30（12）: 77-81.冯唐锴，李思光，罗玉萍，匡燕云. 植物 -胡萝卜素羟化酶研究进展.生物技术通报.2007,1:54-58贾东杰 1，樊连梅 1，沈俊岭 1，秦 松 2，李富超 2，刘成连 1，原永兵 1,*.虾青素合成关键酶基 因 bkt 在Brookfield Gala苹果中的遗传转化及表达 .园艺学报,2013，40（1）：2131滕长英 1 , 张立 1
9、 , 秦松 2 , 曾呈奎 2.雨生红球藻 -胡萝卜素酮化酶基因的 cDNA 和 基因组 DNA 克隆及序列分析.海洋科学. 2006, 30（8）: 20-27.王潮岗,张雪芹,胡章立 *.雨生红球藻基因组文库的构建及鉴定.基因组学与应用生物学.2013,32(2):190-195WEI Wei1 , 2 , LIANG Cheng-Wei1 , 2 and QIN Song1.FUNCTIONAL ANALYSIS OF THE PROMOTER OF BKT ENCODING BETA-CAROTENE KETOLASE IN HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS.ACTA H
10、YDROBIOLOGICA SINICA.2006,30(6):747-751杨晓娜, 赵昶灵 , 李云, 李会容, 苏丽, 周燕琼.启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展 .云南农业大学学报.2010,25(2):283-290尹辉,李丹,张毅,李秋莉 .植物基因启动子的克隆方法及其应用.分子植物育种.2006,4(3s):85-91吴炳江, 阎鹏磊, 刘东篱, 郑成超, 杨国栋 .拟南芥盐胁迫响应启动子的生物信息学分析.山东农业大学学报(自然科学版), 2010, 41 (2): 164 -168王利军 1 ,范三红 2 ,郭蔼光 2*.拟南芥 ats 1A 基因启动子的克隆和功能分析.西
11、北植物学报 2004,24(10): 18561860陈建红,沈宏 *,吴艳.拟南芥 AHAI 基因启动子的表达特性分析.植物生理学通讯.2008,44(1):87-92习雨琳 1,2 ,周 朋 1 ,宋梅芳 1 ,李志勇 1,3 ,孟凡华 1 ,杨建 平 1,4,*.拟南芥 RBCS-1A 基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价.作物学报.2012,38(9): 1561-1569（2）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题研究内容本项目拟利用酵母双杂交、转录组学等技术获得并鉴定 -胡萝卜素酮化酶基因( bkt)启动子的转录调控蛋白，研究转录因子与顺式作用元件间的相互作用
12、，证明转录因子的生物学功能，描述 bkt 转录调控的分子机制，具体的研究内容如下：（1）bkt1 启动子的序列分析参照 Plaza 数据库(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)列出的衣藻基因组序列, 结合 bkt 信息, 选取该基因上游顺式作用元件序列, 并结合基因顺式作用元件数据库 PLACE(http:/www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)进一步解析其中包含的应答顺式作用元件。（2）bkt1 启动子的获得和表达载体构建A、雨生红球藻 DNA 的提取：以对数生长期的雨生红球藻为材料提取 DNA,采用
13、酚氯仿抽提法；B、PCR 扩增：根据 GENBANK 中雨生红球藻基因组序列中 bkt1 启动子的序列设计合成用 PCR 扩增的引物；C、PCR 反应完成后,经琼脂糖电泳检测扩增片段的大小和特异性,按 PCR 产物回收试剂盒操作指南纯化目的片段。将回收到的目的片段克隆到 pMD18-T 载体上,将重组质粒送测序，利用 DNAMAN 比对测序结果与雨生红球藻基因组序列；D、通过双酶切克隆得到的启动子和载体 pH124（带有 Luc 片段的,作为报告基因）酶切切下来，得到启动子片段和载体片段；E、以 T4 连接酶连接得到的启动子和带有荧光素酶蛋白的载体连接得到 pL-bkt1。（3）bkt1 启动
14、子转录因子的获得A、以 bkt1 启动子基因序列作为同位素探针；B、通过电泳迁移率变动分析（EMSA）技术得到与启动子相结合的蛋白；C、对相结合的蛋白上质谱进行氨基酸序列分析，反向分析得到其基因序列，克隆的 pET-28a 中，可经 IPTG 诱导进行原核表达大量获得该蛋白，为后续的体外实验分析准备；E、将 bkt1 启动子连接到酵母转化载体中，转化入酵母中去，并将雨生红球藻的 cDNA 与酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入细胞，通过酵母单杂交得到结合到启动子的转录因子基因序列。F、通过染色体免疫共沉淀（ChIP ）技术与基因芯片结合的 CHIP-on-chip 方法对与 bkt1 结
15、合的转录因子进行筛选或转录因子会结合的位点；G、将上述方法得到的序列通过数据库分析对比，并将序列与载体 pL-bkt1 连接。（4）bkt1 启动子转录因子的生物信息学分析对雨生红球藻进行培养，进行强光胁迫后，分别提取 0h、1h、3h、5h、8h 的RNA 进行转录组学分析胁迫后转录因子的变化，并且通过转录因子（TRANSFAC）数据库分析，得到转录因子在基因组上的结合位点和与 DNA结合 profile 的数据库分析。（3）bkt1 转录因子生物学功能的研究A、 通 过 基 因 敲 除 验 证 转 录 因 子 的 作 用 ： 利 用 前 面 构 建 好 的 pL-bkt1 与 转 录因 子
16、 重 组 质 粒 ， 将 经 过 功 能 验 证 的 bkt1 转 录 因 子 进 行 基 因 敲 除 ， 在 对 bkts的 转 录 水 平 和 报 告 基 因 进 行 分 析 。 最 后 ， 通 过 转 基 因 技 术 对 转 录 因 子 的 功 能进 行 分 析 和 报 告 基 因 进 行 分 析 ；B、 转 录 因 子 过 表 达 对 细 胞 的 影 响 ： 将 含 有 转 录 因 子 序 列 的 质 粒 通 过 基 因 枪导 入 雨 生 红 球 藻 中 ， 采 用 Hsp70A 启 动 子 热 激 表 达 ， 通 过 分 析 mRNA 的 表达 情 况 ， 研 究 转 录 因 子 过 表 达 对 转 基 因 衣 藻 的 bkt1 启 动 子 调 控 的 影 响 ；研究目标（1）获得调控 bkt1 转录的关键转录因子；（2）弄清 bkt1 转录因子与顺式作用元件元件结合的分子机制；（3）弄清 bkt1 转录因子的生物学功能；拟解决的关键科
