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1、1嘌呤类药物作用及巯基嘌呤甲基转移酶遗传多态性的研究进展 关键字：嘌呤类药物 目前研究结果表明治疗急性淋巴细胞白血病(ALL) 的抗嘌呤代谢药物6-巯基嘌呤(6-MP)和 6-巯代鸟嘌呤 (6-TG)均是无内在生物活性的药物必须通过体内一系列代谢后才能发挥抗白血病效应。而人体一种被称为巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)的代谢酶在此类药物代谢和抗白血病作用中起关键作用。此酶是存在于哺乳动物和禽类细胞中的一种细胞内酶非金属依赖性能利用 S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基的供体和底物结合特异地催化杂环类和芳香类化合物苯环 6-位硫原子的甲基化其内在底物和主要的生物学功能仍然未完全清楚1，2 ，而其
2、 DNA 编码顺序上某个核苷酸碱基点突变是造成嘌呤类药物不同强度的细胞毒作用的基础3 。所以对于 TPMT 酶学特点、其遗传多态性的分子生物学机制以及 6-MP、6-TG 临床关系的研究成为当前研究药代动力学的热点之一。 16-MP 和 6-TG 的代谢4，5 6-MP 的代谢途径：由次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)催化先形成硫基次黄嘌呤单磷酸盐(TIMP)硫基黄嘌呤单磷酸盐(TXMP)硫基鸟嘌呤单磷酸盐(TGMP)后者经磷酸化后分别形成二磷酸盐和三磷酸盐。后三种物质统称为 TGNs它整合到肿瘤细胞中影响 DNA 的复制及 RNA 的表达发挥抗肿瘤作用。6-MPTIMPTGMP 均可由 TP
3、MT 催2化生成甲基化的衍生物 6-meMP6-meTGMP6-meTIMP这些甲基化的化合物属于“无活性”的物质它们能够抑制磷酸核糖焦磷酸化氨基转移酶(PRPP-AT)的活性后者是细胞重新合成嘌呤步骤中的关键酶因此抑制 PRPP-AT 的活性就阻断了肿瘤细胞遗传信息的表达从而达到抗白血病的作用。由黄嘌呤氧化酶催化形成 6-硫基黄嘌呤后再形成尿酸也可生成尿酸排出。 6-TG 的代谢途径：由 HPRT 催化直接形成硫基鸟嘌呤磷酸化合物(TGNs)发挥抗白血病作用。也可由 TPMP 催化生成甲基化的产物如 6-meTG或 me-TGMP达到抗肿瘤的作用。但组织中 TPMP 对 6-TG 的催化效力
4、远比 6-MP 低(约为 1/12)4 ，故此过程并非 6-TG 的主要代谢途径。6-TG 由鸟嘌呤脱氢酶催化生成6-硫基黄嘌呤再由黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸排出。 2TPMT 的酶学特点 2.1 TPMT 的组成结构：由两个具有相同的催化功能单体组成说明 TPMT 的结构并非引起遗传多态性的原因。 TPMT 的分子量大约为 30000。通过提取和分析人肾脏组织中的 TPMT发现它由 245 个氨基酸残基组成。另有人还发现几乎每个依赖 SAM 的甲基转移酶均含有 3 个结构保守的序列 (motif，)，分别含24-， 12-， 12-三个单体结构估计这些序列为酶结合底物的结构域68 。 2.2
5、TPMT 的组织分布：人类 TPMT 首先在肝脏、肾脏中被发现随后陆续地在胃肠道、肺、脑、血液、胎儿、胎盘等组织3中发现。成年人肝细胞的 TPMT 浓度和血液组织中几乎呈直线相关。第 3 个月的胎儿即有 TPMT 的存在其中第 6 个月的浓度及活性和新生儿类似说明 TPMT 的浓度及活性在人体各组织内，甚至肿瘤组织中均存在密切相关性测定红细胞中的 TPMT 浓度即可大致估计其它组织的酶活性910 。 2.3 TPMT 的酶学动力学特征：酶活性随孵育时间、底物浓度、pH 值和离子浓度、底物浓度(红细胞浓度 )的变化而变化11 。TPMT 最佳孵育时间为 60 分钟10 其它参数符合 Michae
6、lis-menten 曲线。同时Krynetski 等11发现在一般组织中 (肝、肾等)酶作用最佳 pH 值为 7.5而血液中为 6.7。 2.4 TPMT 的底物及抑制物：Krynetski 等做了 18 种 6-MP和 6-TG 衍生物的酶学实验包括它们的核苷酸和核糖核酸描述了它们的反应特性：大多数的衍生物均可作为 TPMT 的底物它们的酶促动力学特性均符合 Michaelis-menten 曲线发现 6-MP 比6-TG 与酶结合的能力强。在所有前体药物(6-MP6-TG)和衍生物中8-羟基-6-MP 和 6-TG 分别是两个药物家系中活性最大者而它们的核苷酸盐类则是这些化合物中活性最低
7、的其原因可能是它们较易被水解。Mcleod 等10发现当化合物中 79 位被烷基化后其与酶结合的能力有所加强。同时发现前体药物的 Km、Vm和 Km/Vm 值均比其衍生物低 说明 6-MP 和 6-TG 并非 TPMT 的自然底物。另外6-硒基嘌呤(Selenopurine)及其衍生物也可以作为 TPMT 的底物但是它们的 Km 和 Vm 值均显著比硫基嘌呤及其4衍生物低。黄嘌呤 8 位上有 -OH 基者是底物，而 2 位上有-OH 则为抑制物12 。除 2-OH-黄嘌呤外S-腺苷 -L-半胱氨酸、Sinefungin、6-甲基硫基嘌呤、3，4-双甲氧-5-对羟基苯甲酸为TPMT 的抑制物2
8、。 3TPMT 的遗传多态性从人类 T84 结肠癌患者细胞中提取分析 DNA 及 cDNA 寡核苷酸探针筛查文库发现 TPMT 基因总长为 3.4kb编码序列总长 2.7kb开放阅读框架含 735 个碱基。国外多个文献调查显示大约有 89%的人 TPMT 酶活性6U/mlpRBC属于高活性而 11%的人酶活性为15U/mlpRBC属于中度活性。而大约 1/300 的人活性低于1U/mlpRBC 或其活性无法测出。造成这种结果的原因是编码TPMT 的核苷酸碱基顺序发生点突变而是否有染色体易位或丢失尚无文献报道。美国和英国学者已在白种人中发现和克隆出两个点突变位点分别命名为 TPMT*2 和 TP
9、MT*3。其中前者是核苷酸序列中第 238 位的鸟嘌呤(G)胞嘧啶(C)使得氨基酸序列第 80 位的 Ala(丙氨酸 )Pro(脯氨酸)后者是第 460 位的鸟嘌呤(G) 腺嘌呤(A)第 719 位的腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G)结果是氨基酸序列第154 位的 AlaThr(苏氨酸) 第 240 位的 Tyr(酪氨酸)Cys(半胱氨酸) 这样就造成了酶活性的减低或丧失，从而导致在使用 6-MP时形成高浓度的 TGNs引起明显的造血组织细胞毒性产生严重后果甚至引起死亡。两种突变类型中TPMT*3 出现的频率占两种类型的 70%，而 TPMT*2 占 30%1314 。4影响 TPMT 活5性的因素 4
10、.1 种族特异性：美国弗罗里达州黑种人平均 TPMT 酶活性为 8.643.47U/mlpRBC未发现缺陷患者。而白种人平均为12.33.88U/mlpRBC酶活性的分布比例与前述类似15 。Mcleod 等16发现白种人的酶活性平均值为 16.8U/mlpRBC黑种人则为 14.4U/mlpRBC(P0.001)。法国人平均15.47.0U/mlpRBC其 TPMT 遗传多态性的分布和美国人相同1 。新加坡的调查显示 健康华人中 TPMT 的多态性结论和美国人相似而实际的数值却大大超过了国外报道的结果17 。挪威Saami 人的平均值为 17.03.3U/mlpRBC白种人为13.12.9U
11、/mlpRBC(P0.001)而酶活性的分布比例与前面结果相似18 。同时他们与韩国合作检测韩国人群的酶活性 其结果也类似19 。 4.2 性别：3 篇文献报告在白血病患者中女性的酶活性似比男性高而健康人无明显差别5，8 ，20 。其它的文献结果为无显著差异2，3，17 。 4.3 年龄：文献提示 TPMT 的活性与年龄无相关性9 。 4.4 红细胞寿命及免疫分型：无相关性11 。 4.5 使用 6-MP 前后 TPMT 活性：患者在进行化疗时其体内 TPMT 的活性与用药前相比大约要上升 30%其中以用药前活性最低的患者上升得最快。而用药后约 3 个月又逐渐回到原来水平 其中下降得最快者是用
12、药期间活性上升最高者5，11 。 64.6 慢性疾病：无相关性 11 。 5TGNs 和 TPMT 的关系TGNs 和 TPMT 甲基化是嘌呤类药物治疗白血病的两个重要途径它们之间的关系可以归结如下：高 TPMT 活性的人群形成的 TGNs 量少甲基化产物多；低活性的人群形成的量多甲基化产物少。因此低活性人群 TGNs 虽然能产生强烈的抗肿瘤作用但同时也容易产生毒副作用引起造血组织的致命损伤；而高活性的人群由于体内的 TGNs 量少虽然此副作用弱但出现复发的机率也大21 。 66-TG 和 6-MP 的临床关系由于 6-TG 直接衍生为TGNs而且临床发现患者在使用 6-TG 时较少出现造血组
13、织毒副作用及具较低复发性因此有人建议以它替代 6-MP。但 6-TG 可引起门脉高压，与别嘌呤醇合用时引发较高的毒性而且价格昂贵、半衰期短所以目前临床医生建议和 6-MP 按需选择性交替使用22 。此外6-MP 和 6-TG 的作用机制也稍有不同前者作用于细胞周期的 G1/S 期而后者作用于 S/G2 晚期6-MP 使嘌呤再合成受阻而 6-TG 则使染色体“变性” 可能引起严重的治疗后期不良反应故当患者酶活性低时可适当降低药物剂量有文献报道将剂量降低 90%时所产生的疗效和正常剂量无显著差异。另有文献报道酶活性低患者当降低 6-MP 剂量时如果和甲氨喋呤(MTX)联用可产生较好的疗效。其机制为
14、抑制嘌呤合成后产生大量磷酸核糖焦磷酸盐后者可以整合到细胞 DNA 中抗肿瘤。而当患者酶缺陷时应大规模减少剂量或选择换用其它药物。由于大多数患者在治疗前其7体内 TPMT 活性未知因此在用药时较难避免造血组织毒性 加大了治疗的难度及影响疗效。此外输血可能造成测定时的误差应引起注意23 。 7研究嘌呤类药物和 TPMT 的意义进行此项研究的意义在于：测定 6-MP 原发性耐药个体避免患者对药物不敏感造成维持治疗期的复发贸然加大剂量同时也易产生毒副反应。测定 TGNs 浓度 避免高浓度时患者对药物过度敏感产生造血组织抑制和肝脏损害被迫终止维持治疗使化疗不能长期、规则、正常地进行从而容易复发。避免由于造血组织的毒性使得全身免疫能力下降产生继发感染引发死亡或其它严重的反应。因此认识中国人 6-MP 药代动力学深入研究 TPMT 表现型和基因型了解其遗传多态性的分布和机制掌握药物代谢过程中的各种数据就可针对每个患者不同酶活性和 TGNs 而制定相应的用药方案使治疗个体化提高急性白血病尤其是 ALL 的远期疗效乃至提高长期无病生存率。
