《代谢工程方法改造谷氨酸棒状杆菌生产乙偶姻（学位论文-工学）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《代谢工程方法改造谷氨酸棒状杆菌生产乙偶姻（学位论文-工学）（71页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、代谢工程方法改造谷氨酸棒状杆菌生产乙偶姻Metabolic engineering of Corynebacteriumglutamicum for acetoin production国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 资 助 （ NSFC-21176182）国 家 973 项 目 资 助 （ 2011CBA00804, 2012CB725203）学 科 专 业 ： 生 物 化 工研 究 生 ： 刘 会 娟指 导 教 师 ： 马 红 武 副 教 授天 津 大 学 化 工 学 院二 零 一 三 年 六 月独 创 性 声 明本 人 声 明 所 呈 交 的 学 位 论 文 是 本 人
2、在 导 师 指 导 下 进 行 的 研 究 工 作 和 取 得 的研 究 成 果 ， 除 了 文 中 特 别 加 以 标 注 和 致 谢 之 处 外 ， 论 文 中 不 包 含 其 他 人 已 经 发 表或 撰 写 过 的 研 究 成 果 ， 也 不 包 含 为 获 得 天津大学 或 其 他 教 育 机 构 的 学 位 或 证书 而 使 用 过 的 材 料 。 与 我 一 同 工 作 的 同 志 对 本 研 究 所 做 的 任 何 贡 献 均 已 在 论 文 中作 了 明 确 的 说 明 并 表 示 了 谢 意 。学 位 论 文 作 者 签 名 ： 签 字 日 期 ： 年 月 日学 位 论 文
3、 版 权 使 用 授 权 书本 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解 天津大学 有 关 保 留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定 。特 授 权 天 津 大 学 可 以 将 学 位 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 编 入 有 关 数 据 库 进 行 检索 ， 并 采 用 影 印 、 缩 印 或 扫 描 等 复 制 手 段 保 存 、 汇 编 以 供 查 阅 和 借 阅 。 同 意 学 校向 国 家 有 关 部 门 或 机 构 送 交 论 文 的 复 印 件 和 磁 盘 。（ 保 密 的 学 位 论 文 在 解 密 后 适 用 本 授 权 说 明 ）学 位 论 文 作 者 签 名
4、： 导 师 签 名 ：签 字 日 期 ： 年 月 日 签 字 日 期 ： 年 月 日摘 要乙 偶 姻 作 为 一 种 重 要 的 平 台 化 合 物 ， 广 泛 应 用 于 食 品 、 医 药 和 其 它 行 业 。 谷氨 酸 棒 状 杆 菌 是 安 全 的 革 兰 氏 阳 性 菌 ， 好 氧 培 养 时 菌 体 密 度 较 高 ， 底 物 消 耗 速 率快 ， 可 以 获 得 较 理 想 的 产 物 生 产 率 。 本 文 围 绕 乙 偶 姻 生 物 合 成 反 应 ， 以Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 为 出 发 菌 株 进 行 代 谢 工 程
5、改 造 ， 旨 在 利用 代 谢 工 程 方 法 改 造 谷 氨 酸 棒 状 杆 菌 生 产 乙 偶 姻 ， 并 提 高 其 产 量 和 得 率 。首 先 在 C. glutamicum ATCC 13032 中 表 达 Bacillus subtilis 168 乙 偶 姻 合 成 关键 基 因 alsSD 操纵子，得到乙偶姻生产菌株；进而敲除丙酮酸脱氢酶复合体 E1亚基基因和乳酸脱氢酶基因，敲除 2,3-丁二醇脱氢酶基因（butA） ， 提 高 乙 偶 姻得 率 ； 进 一 步 研 究 转 速 对 菌 株 CGL4 乙 偶 姻 生 产 的 影 响 ； 最 后 利 用 丰 富 培 养 基 对
6、菌 株 CGL4 发 酵 培 养 ， 提 高 乙 偶 姻 生 产 力 。在 谷 氨 酸 棒 状 杆 菌 和 大 肠 杆 菌 穿 梭 质 粒 pEC-XK99E 上 插 入 来 自 于 B. subtilis168 生 产 乙 偶 姻 的 alsSD 操 纵 子 ， 得 到 乙 偶 姻 表 达 质 粒 pEC-XK99E-alsSD。 将 质粒 转 化 C. glutamicum ATCC 13032 得 到 菌 株 CGL1。 野 生 型 菌 株 和 工 程 菌 株 CGL1的 乙 酰 乳 酸 合 成 酶 ALS 酶 活 测 定 结 果 显 示 ， 与 野 生 型 菌 株 相 比 CGL1 乙
7、 酰 乳 酸合 成 酶 比 酶 活 提 高 了 17 倍 ， 同 时 CGL1 生产了 2.14 g/L 乙 偶 姻 。为 了 提 高 乙 偶 姻 的 产 率 ， 增 加 合 成 乙 偶 姻 的 前 体 物 质 丙 酮 酸 的 供 给 ， 减 少 副产 物 乳 酸 的 生 成 ， 通 过 蔗 糖 负 筛 选 无 痕 敲 除 方 法 敲 除 aceE 和 ldhA 基 因 ， 得 到 双基 因 敲 除 菌 株 CGL2。与 CGL1 相比乙偶姻的产量提高到 5.09 g/L， 发 酵 产 物 未检 测 到 乳 酸 ， 有 微 量 的 2,3-丁 二 醇 。 进 一 步 阻 断 乙 偶 姻 消 耗
8、 途 径 ， 敲 除 CGL2 潜在 的 2,3-丁 二 醇 脱 氢 酶 基 因 butA。 发 酵 结 果 显 示 ， 失 活 butA 基因可以完全阻断2,3-丁 二 醇 的 生 成 途 径 ， 乙 偶 姻 产 量 提 高 到 5.88 g/L。代 谢 工 程 改 造 菌 株 CGL4 在 发 酵 过 程 中 检 测 到 有 副 产 物 琥 珀 酸 的 积 累 ， 为 了进 一 步 提 高 乙 偶 姻 的 产 量 ， 减 少 副 产 物 琥 珀 酸 的 生 成 ， 考 察 了 转 速 对 菌 株 发 酵 生产 乙 偶 姻 的 影 响 。 实 验 结 果 显 示 150 rpm 为 最 佳
9、转 速 ， 此 条 件 下 乙 偶 姻 产 量 为 8.33g/L， 达 到 理 论 得 率 的 51.5%。最 后 选 用 丰 富 培 养 基 添 加 65 g/L 葡 萄 糖 对 菌 株 CGL4 发酵培养，150 rpm 条件 下 ， 生 成 22.44 g/L 乙 偶 姻 。 乙 偶 姻 的 产 量 达 到 理 论 得 率 的 70.5%， 生 产 力 提高 到 0.44 g/(hL)， 与 基 本 培 养 基 相 比 生 产 力 提 高 了 1.16 倍 。 以 上 研 究 表 明 ， 利用 代 谢 工 程 方 法 改 造 谷 氨 酸 棒 状 杆 菌 生 产 乙 偶 姻 有 一 定
10、的 工 业 应 用 潜 力 。关 键 词 ： 乙 偶 姻 谷 氨 酸 棒 状 杆 菌 代 谢 工 程 乙 酰 乳 酸 合 成 酶 乙 酰 乳 酸 脱 氢酶ABSTRACTAcetoin is an important platform compound, widely used in food and otherindustries. Corynebacterium glutamicum is fast-growing Gram-positive soil bacteriumand achieves high cell densities under aerobic condition, wh
11、ich could obtain desiredproductivity. Focusing on the acetoin biosynthetic reactions, C. glutamicum ATCC13032 was engineered as the starting strain, aiming at enhancing the acetoin yield andproductivity with C. glutamicum ATCC 13032 by metabolic engineering.The alsSD operon for acetoin production fr
12、om Bacillus subtilis 168 wasexpressed in C. glutamicum ATCC 13032. Additional inactivation of aceE geneencoding the E1p enzyme of the pyruvate dehydrogenase complex, ldhA geneencoding NAD+-dependent L-lactate dehydrogenase and butA gene encoding2,3-butanediol dehydrogenase increased acetion producti
13、on. Subsequently, the effectof rotation speed on acetoin production was explored. At last, the fermentation ofstrain CGL3 was carried out in rich medium to increase acetion productivity.The alsSD operon for acetoin production from Bacillus subtilis 168 was insertedin C. glutamicum-Escherichia coli s
14、huttle plasmid pEC-XK99E, the resulting plasmidpEC-XK99E-alsSD was transformed into C. glutamicum ATCC 13032 and got strainCGL1. The acetolactate synthase activity was performed, and the acetolactatesynthase activity of CGL1 increased by 17 fold compared with wild-type strain. StrainCGL1 produced 2.
15、14 g/L acetoin.Additional inactivation of aceE and ldhA gene increased the supply of acetoinprecursor and decreased the production of lactate. The aceE-ldhA double-knockoutstrain CGL2 generated 5.09 g/L acetoin. Lactate was not detected in strain CGL2.However CGL2 produced little 2,3-butanediol in c
16、ulture. ButA gene encoding2,3-butanediol dehydrogenase was deleted to decrease the depletion of acetoin, andthe production of acetoin increased to 5.88 g/L.Succinic was detected in strain CGL4. In order to decrease the production ofby-product, the effect of rotation speed on acetoin production was explored. The finalstrain CGL4 accumulated up to 8.33 g/L acetoin under optimum fermentationconditions, and the acetoin yield reached 5
