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1、1可吸收性材料 CPP 生物安全性评价作者：杨团民，张庆华，薛金山，贺增良，李毅，焦宁，张文【关键词】 聚磷酸钙纤维；可吸收性植入物；毒理学；安全性Biological security evaluation of an absorbable CPP material【Abstract】 AIM: To evaluate the biological security of a new kind of absorbable CPP material used for internal fixation of fracture. METHODS: Maximal tolerant dose of
2、 CPP was determined by intraperitoneal (ip) injection of its extractives to mice, and micronucleus test of bone marrow cells, spermatic aberration test, chromosomal aberration test, and teratogenic test were done by ip injection of maximal tolerant dose of CPP to evaluate its biological security. CP
3、P intramuscular implantation was performed to observe its surrounding tissue reaction and evaluate its biological compatibility. RESULTS: Maximal tolerant dose of CPP extractives was above 40 mL/kg, and this dose did not have any obvious effects on micronucleus rate of bone marrow 2cells (1.360.27),
4、 chromosomal aberration rate (1.940.46)%, spermatic aberration rate (1.510.37)% and teratogenic rate (1.840.55)% when compared with controls. CPP intramuscular implantation also did not cause obvious surrounding tissue inflammatory reaction. CONCLUSION: CPP is a new safe medical material with good t
5、issue compatibility.【Keywords】 calcium polyphosphate fibers; absorbable implants; toxicology; security【摘要】 目的: 评价 CPP 材料的生物安全性. 方法: 采用聚磷酸钙（CPP）材料萃出液腹腔注射（IP）最大允许剂量，进行了该材料最大耐受量测定，并用 IP 最大耐受量进行了小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸变试验、小鼠骨髓细胞染色体畸变试验、致畸试验等毒理学试验，评价其安全性；同时采用体内肌肉包埋法，观测其对对周围组织的反应，对 CPP 材料生物相容性进行评价. 结果: CPP 材料萃出液
6、的最大耐受量大于 40 mL/kg，最大耐受量的 CPP对小鼠骨髓细胞微核率(1.360.27)，小鼠骨髓细胞染色体畸变率（1.940.46)%和小鼠精子畸变率（1.510.37）% ，致畸试验畸发率(1.840.55)%和对照组比差异无统计学意义(P0.05) ，CPP材料肌肉包埋后组织反应不明显. 结论: CPP 材料是一种安全而理想的可吸收性生物医用材料.3【关键词】 聚磷酸钙纤维；可吸收性植入物；毒理学；安全性0 引言为研制可吸收性高强度骨折内固定复合材料，我们选用在化学和晶体学特征上与人体骨矿物质相近的聚磷酸钙（calcium polyphosphate, CPP）, 经熔融抽丝工艺
7、制得可吸收性高强度复合材料增强物CPP 纤维，为判定其是否满足医用要求，我们参照国内外相关文献，采用 CPP 材料萃出液腹腔注射最大允许剂量，进行了该材料毒理学试验；同时采用体内肌肉包埋，观测其对组织学的反应，对 CPP 材料安全性进行评价.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 聚磷酸钙纤维制备1-2采用化学成分与人体骨矿物质成分相近的化学纯磷酸二氢钙(或偏磷酸钙)为主要原料，通过添加适量的稳定剂 S 和阻降剂 M，置于坩埚中，一并放入自制的拉丝炉中，缓慢升温至 1000. 原料先变为白色粉末,继而成为液态,然4后使其缓慢冷却,在冷却过程中以自制拉丝机拉丝，用熔融拉丝的方法，制备出聚磷酸钙纤维
8、. 以 19JA 型万能工具显微镜测得单丝直径在 5250 m 范围内，密度为 2.3 g/cm3.1.1.2 动物昆明种健康小鼠（西安交通大学医学院实验动物中心提供） ，体质量 1822 g；健康新西兰兔(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，体质量 2.02.5 kg.1.2 方法1.2.1CPP 材料萃出液的制备参照文献3 ，取直径 50 m CPP 纤维 30 cm，经灭菌处理后，放入 100 mL 无菌生理盐水中，37下密闭温育 72 h，制备萃出液备用.1.2.2CPP 材料萃出液最大耐受量测定按国标（GB1519394）4方法进行. 昆明种小鼠 20 只，雌雄各半，体质量 182
9、2 g, 禁食而不禁水 12 h 后腹腔注射 CPP 复合材料萃出液每 1 kg 质量40 mL，观察 7 d 内动物反应及死亡情况 .1.2.3 小鼠骨髓细胞微核试验按国标（GB1519394） 4方法进行. 昆明种小鼠 30 只，雌雄各半，体质量 1822 g, 随机分为CPP 试验组（IP 最大耐受量的 CPP 萃出液） 、阴性对照组（生理盐5水）和阳性对照组（环磷酰胺 40 mg/kg）共三个试验组. 每日 IP给药 1 次，共 7 次，于末次给药后 6 h 脱臼处死，取胸骨制成骨髓涂片，Gimsa 染色，每只小鼠计数嗜多染红细胞 1000 只，计算微核发生的千分率.1.2.4 小鼠精
10、子畸变试验按国标（GB1519394） 4方法进行. 体质量 2535 g 雄性小鼠 30 只，分组给药同 1.4 微核试验. 阳性对照用乙酰水杨酸，于末次给药后 6 h 用颈椎脱臼法处死小鼠，取出两侧副睾，放入盛有适量生理盐水（1 mL）的平皿中. 用眼科剪将副睾纵向剪 12 刀，静置 35 min，轻轻摇动. 用四层擦镜纸过滤，吸滤液涂片. 于空气中干燥后，甲醇固定. 用 1020 g/L 伊红染色 1 h，用水轻冲，干燥 . 在低倍镜下找到背景清晰、精子重叠较少的部位，用高倍镜顺序检查精子形态，计数结构完整的精子. 每只小鼠至少检查 1000 个精子. 以便统计精子畸形率 .1.2.5
11、小鼠骨髓细胞染色体畸变试验按国标（GB1519394）4方法进行. 分组给药同 1.4 微核试验. 阳性对照组小鼠处死前24 h，按 4 mg/kg 体质量腹腔注入秋水仙素. 小鼠颈椎脱臼处死，取股骨，去除附着的肌肉，剪去两端骨骺，用带针头的注射器吸取24 mL 22 g/L 柠檬酸钠溶液，将骨髓洗入 10 mL 离心管中，反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色，然后以 10001500 r/min 离心 10 min，弃去上清液. 离心后的细胞沉淀物加入 4 mL 675 mmol/L 氯化钾溶液低渗处理，用新配制甲醇冰乙酸固定液固定，细胞悬液制片，Giemsa 染色，空气中自然干燥后镜检.
12、每只动物分析 100 个中期相细胞，每组不少于 1000 个中期相细胞. 观察染色体数目和结构改变.1.2.6 致畸试验按国标（GB1519394） 4方法进行. 健康性成熟昆明种小鼠，雌性 60 只，雄性 30 只，按二雌一雄合笼交配，将每天检出的受孕雌鼠，按微核试验平均随机分配，每剂量组受孕鼠为 20 只. 每剂量组的孕鼠检出精子的当天作为受孕 0 d，于小鼠孕期 615 d 给药，阳性对照为乙酰水杨酸. 于孕期第 20 日将孕鼠颈椎脱臼处死，剖检子宫及胎仔，检查胎仔有无畸形.1.2.7 肌肉包埋试验将自制 CPP 制成直径为 2 mm，长 10 mm 的柱状体，环氧乙烷消毒备用. 用常规
13、骨水泥(PMMA)制成同样大小的棒材作对照. 取健康新西兰兔 12 只，体质量 2.02.5 kg，手术前 1 d 背部脊柱两侧备皮，戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉，取背部正中纵行切口，钝性分离右侧竖脊肌，植入 CPP 棒材共 4 枚，平行于脊柱，离中线 25 mm，各植入物间隔约 25 mm， 同法在对侧植入 PMMA 骨水泥作对照，逐层缝合至皮肤. 于术后1，4 ，8 ， 12 wk 分别处死动物 3 只，切取实验组及骨水泥组周围肌肉组织做常规病理切片， HE 染色. 观察材料周围组织炎症细胞变化情况、纤维包膜形成情况及有无肌肉钙化、坏死. 按国标7（GB/T 161751996） 5对肌肉包埋
14、实验炎症细胞反应、纤维囊腔形成进行分级后评价.统计学处理：应用 SPSS 12.0 统计软件包进行统计分析,经检验, 实验数据均符合正态分布, 故采用 xs 表示，组间比较采用KruskalWallis 检验, 多重比较采用 Nemenyi 检验.2 结果2.1CPP 材料萃出液最大耐受量预试验结果表明， CPP 材料基本无毒，测不到 LD50；最大耐受量测定结果表明，一次腹腔注射 CPP 材料萃出液每 1 kg 质量 40 mL，观察 7 d 内小鼠未见死亡，也未见异常反应. 说明 CPP 材料萃出液对小鼠的最大耐受量大于 40 mL/kg.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验 CPP 组的微核细胞
15、数和阴性对照组相似，差异无统计学意义(P0.05)，而环磷酰胺组的微核细胞数，和阴性对照组相比差异有统计学意义(P0.05)，而阳性对照组的精子畸变率和阴性对8照组相比差异有统计学意义(P0.05)，而阳性对照组的染色体畸变率和阴性对照组相比差异有统计学意义(P0.01，表 2).2.5 致畸 CPP 组和对照组胚仔外观和内脏发育未出现明显畸变. 而乙酰水杨酸组则出现胚仔头面与身体的畸形如脑露、脊椎裂，侧脑室扩大，脑骨、骨柄、颞骨、蝶骨、枕骨的未骨化和骨化不全等，总畸变率为（80.1011.00）%（表 2）.表 2CPP 材料毒理学检测结果（略）2.6CPP 材料肌肉植入试验对兔肌肉组织反应261 实验动物的大体观察所有动物均成活，伤口无红肿，愈合良好，无感染及窦道产生，未见变态反应、中毒及热源反应. 手术伤口愈合良好，未见感染及窦道产生.262 试件标本的大体观察术后 1 wk，试件表面光泽稍暗淡，光滑平整；4 wk，试件形态无变化，透明度稍有降低；8 wk，试件透明度呈不均匀降低，形态仍无变化；12 wk，试件呈不均匀乳白色，表面光洁度下降， 试件仍完整，表面有点凹状吸收.9263 组织切片光镜观察 CPP 棒植入兔竖脊肌后 HE 染色观察：1 wk，未见纤维囊形成，可见较多的炎性细胞浸润
