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1、1原癌基因 PIK3CA 在宫颈癌组织中的表达及意义作者：王洪艳 崔竹梅 刘湘萍 隋爱华 杨堃 孙显路 【摘要 】 目的 研究原癌基因 PIK3CA 在宫颈癌组织中的表达及其意义。方法 用 RTPCR 方法检测 PIK3CA mRNA 在 15 例正常宫颈组织和 30 例宫颈癌组织中的表达,免疫组化方法检测其蛋白在50 例宫颈癌前病变组织及 20 例宫颈癌组织中的表达情况。结果 从宫颈上皮内瘤样病变(CIN)到宫颈癌的发展过程中，PIK3CA 的蛋白表达产物 PI3K p110a 蛋白表达水平逐渐增加 (Hc=9.968,P0.05)；PIK3CA mRNA 在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达
2、差异有显著性(t=2.672,P0.05)。结论 PIK3CA 基因改变与宫颈癌的发生发展有关，宫颈癌的发展过程伴随着 PI3K p110a 蛋白的表达异常。 【关键词】 宫颈肿瘤；宫颈上皮内瘤样病变；原癌基因蛋白质PIK3CA；免疫组织化学 ABSTRACTObjectiveTo explore the expression of protooncogene PIK3CA in cervical cancer and its significance.MethodsThe expressions of PIK3CA mRNA in normal cervical tissue (15 cas
3、es) and cervical cancer tissue (30 cases) were detected by RTPCR, and PIK3CA protein in cervical intraepithelial neoplasia (CIN, 50 cases) and cervical 2cancer (20 cases) detected by immunochemistry.ResultsThe expressions of PIK3CA mRNA were significantly different between the tissues of normal cerv
4、ix and cervical cancer (t=2.672,P0.05). In the process from CIN to cervical cancer, the PIK3CA protein products (PI3K and p110a) increased dramatically (Hc=9.968,P0.05).ConclusionThe changes of PIK3CA gene is related to the morbidity of cervical cancer, the process of the cancer is followed by incre
5、asing expression of PI3K and p110a protein. KEY WORDSCervix neoplasms; Cervical intraepithelial neoplasia; Protooncogene proteins PIK3CA; Immunohistochemistry 宫颈癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，流行病学研究显示，宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒（HPV）感染关系密切。生育期妇女中 HPV 感染非常普遍，然而只有一小部分妇女发生宫颈癌,因此, 除了 HPV 感染以外宫颈癌的发生还存在其他的必要因素。与其他肿瘤一样，宫颈癌的发生也被认为是与癌
6、基因激活或抑癌基因失活有关的多步骤的发展过程1。PIK3CA，编码磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）的 p110a 亚基，已被证实是一种癌基因，人类多种恶性肿瘤中都存在该基因的突变。本实验应用免疫组化方法和 RTPCR方法, 检测 PIK3CA 在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中的表达变化,以探讨其在宫颈癌发生与发展中的作用。现将结果报告如3下。 1 材料与方法 1.1 标本及其来源 宫颈鳞癌组织标本 30 例, 病人年龄 2849 岁，平均 39.13 岁，术前均未进行放疗或化疗，其中期 22 例， 期 8 例；高分化 10例，中分化 12 例，低分化 8 例。所有标本均取自青岛大学医学
7、院附属医院妇科住院的病人。标本取得后一部分迅速置于-80 超低温冰箱保存备用,其余送病理科进行病理学诊断, 其中 20 例宫颈鳞癌组织标本（高分化 6 例，中分化 9 例，低分化 5 例）同时进行石蜡包埋，制成组织切片备用。正常对照标本 15 例,均为子宫肌瘤手术切除的正常宫颈组织。另外,对本院病理科 20042006 年间 50 例石蜡包埋的宫颈组织切片进行回顾性分析，其中正常宫颈切片 15例，宫颈上皮内瘤样病变(CIN)者 10 例， CIN 者 25 例。 1.2 PIK3CA 蛋白表达产物 PI3K p110a 蛋白检测 采用免疫组织化学 PV6000 二步法。试剂兔抗人 PI3 Ki
8、nasep110alpha 抗体购自 CellSignaling Technology 公司，工作浓度为 125；通用型 PV6000 二步法免疫组化检测试剂盒购自中杉金桥公司。组织切片脱蜡处理后水化，灭酶，然后置于 0.01 mol/L 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中,微波炉加热至 95 共1015 min 进行抗原修复, 按照试剂盒说明书依次滴加一抗、通用型二抗,最后切片经梯度乙醇脱水, 干燥,二甲苯透明, 中性树胶封固,显微镜观察结果。 4结果判断：用已知的阳性对照片作阳性对照，以 PBS 液代替一抗作阴性对照。PI3K p110a 蛋白阳性染色位于胞浆。高倍镜下随机选 4 个视野，结
9、合阳性细胞百分率和染色强度进行半定量分级，然后取平均值。染色强度判定标准如下：胞浆内无着色为 0 分，淡黄色为 1 分，棕黄色为 2 分，棕褐色为 3 分；阳性细胞百分率判定：阳性细胞百分率5%为 0 分，5% 25% 为 1 分，26%50%为2 分，51%75%为 3 分，75%为 4 分。两项结果相加2 分为阴性(-)，2 3 分为弱阳性(+)，4 5 分为中度阳性() ，67 分为强阳性() 。 1.3 PIK3CA mRNA 表达水平的检测 1.3.1 总 RNA 提取及逆转录 按 Trizol 试剂（购自 Invitrogen 公司）说明书提取组织总RNA，并测定 RNA 纯度，按
10、照 MMLV 反转录试剂盒（购自Promega 公司）推荐的 50 L 体系进行逆转录反应，合成cDNA。 1.3.2 引物序列 PIK3CA（Genbank NO:NM006218）:上游引物5CCCTGCTCATCAACTAGGAAACC3,下游引物5TTGCCGTAAATCATCCCCATT3，共 160 bp。GAPDH(Genbank:NM002046):上游引物5GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3, 下游引物5GAAGATGGTGATGGGATTTC3,共 226 bp。引物由上海生工5公司合成。 1.3.3 PCR 反应 以合成的 cDNA 作为反应模板, 反应体系 100
11、 L，包括cDNA 20 L，dNTP 混合物（10 mmol/L ）1.8 L，MgCl2 （25 mmol/L）7.5 L，10逆转录缓冲液 9.8 L，上下游引物各 50 pmol，Taq DNA 聚合酶 2.5 U，加无 RNA 酶水至终体积 100 L。反应条件：94 预变性 3 min;94 变性 30 s,60 退火 30 s，72 延伸 1 min，共 35 个循环;最后 72 延伸 10 min。内参照物为 GAPDH，反应条件：94 预变性 3 min;94 变性 30 s,56 退火 30 s，72 延伸 1 min，共 28 个循环;最后 72 延伸 10 min。 1
12、.3.4 PCR 产物半定量分析 将上述扩增产物在 20 g/L 琼脂糖凝胶中电泳，紫外线透射凝胶成像仪上观察电泳条带，并经扫描系统分析其灰度值，以PIK3CA/GAPDH 表示 PIK3CA mRNA 的相对表达水平，采用分析软件对电泳条带进行半定量分析，最后将 PCR 产物送上海生工公司进行测序。 1.4 统计学分析 应用 SPSS 11.5 软件进行数据处理，数据间比较采用 t 检验、方差分析和秩和检验。 2 结果 2.1 宫颈癌组织 PI3K p110a 蛋白的表达 6PIK3CA 基因表达产物 PI3K p110a 蛋白在各组织中表达情况见表 1。PI3K p110a 蛋白在宫颈癌组
13、织中强阳性表达最高，而在正常宫颈和 CIN组中无强阳性表达，其在正常宫颈、CIN、CIN 、宫颈癌间表达差异有统计学意义（Hc=9.968,P0.05） ，而 CIN组、CIN 组与宫颈浸润癌组织间差异均有显著性（P0.05） 。表 1 各组 PI3K p110a 蛋白的表达（略） 2.2 宫颈癌 PIK3CA mRNA 的表达 将 PCR 产物测序所得序列与 Genbank 公布的 PIK3CA 序列进行比对，证实 PCR 扩增产物为 PIK3CA。30 例宫颈癌组织有 12 例PIK3CA mRNA 高表达， 而 15 例正常宫颈组织无 PIK3CA mRNA高表达（图 1） 。宫颈癌组织
14、 PIK3CA mRNA 表达水平为1.240.53，正常宫颈组织为 0.890.09，两者比较，差异有显著意义（t=2.672，P0.05） 。 3 讨 论 宫颈癌是女性较常见的恶性肿瘤，发病率位于女性肿瘤的第二位。全世界每年大约有 20 万妇女死于这种疾病。在发达国家，宫颈癌发病率已明显下降，这主要归因于对宫颈癌前病变的早期诊断和治疗。在发展中国家，由于宫颈疾病筛查工作不完善，女性对宫颈疾病的忽视，致使我国宫颈癌的发病率是发达国家的 6 倍，而且宫颈7癌的发病年龄也越来越年轻化。流行病学研究显示，宫颈癌的发生与 HPV 感染关系密切，尤其是高危型 HPV 感染2。尽管在生育期妇女中 HPV
15、 感染非常普遍，然而只有一小部分妇女发生宫颈上皮内瘤样病变（CIN） ，发展到浸润性癌的就更少了，因此 HPV 感染并不是独立致病因素。基因突变是恶性肿瘤发生发展的根本原因，而与细胞生长调控有关的基因突变在肿瘤形成中尤为常见，与其他肿瘤一样，宫颈癌的发生也被认为是与癌基因激活或抑癌基因失活有关的多步骤的发展过程。 3 号染色体长臂的扩增是宫颈癌中最常存在的基因改变,也与宫颈不典型增生细胞演化为侵袭性癌有关,PIK3CA 定位于 3 号染色体3q26.3，编码 IA 类磷脂酰肌醇 3 激酶(PI3K)的 p110a 催化亚单位，全长 34 kb，包含 20 个外显子，编码 1 068 种氨基酸，产生相对分子质量为 124 000 的蛋白。PI3K 及其下游分子丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶(AKT)所组成的信号通路调控细胞的正常生长和凋亡，是近年来肿瘤研究中的热点。信号途径中某些成分的突变所导致的功能获得或功能缺失使该途径被激活，从而导致异常的细胞周期演进，细胞活力和黏附能力改变，凋亡受抑制，血管生成增加，导致肿瘤细胞的增殖和存活。在多种人类恶性肿瘤组织中存在频繁的PI3K/AKT 信号通路的异常改变5。 PIK3CA 已被证实是一种癌基因，由于 PIK3CA 基因突变导致的PIK3CA 的过度表达可以导致 PI3K 的催化活性增强，促使细胞癌变3。在人类多
