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1、T4 DNA Polymerase，即 T4 DNA 聚合酶，是一种模板依赖的 DNA 聚合酶，可以在结合有引物的单链 DNA 模板上，从 53方向催化 DNA 合成反应。T4 DNA Polymerase 具有35外切酶活性，但不具有 53外切酶活性。特点：T4 DNA Polymerase 由于同时具有 53DNA 聚合酶活性和 35DNA 外切酶活性，可以用于将 5端突出末端补平或 3端突出末端削平。T4 DNA Polymerase 的 35DNA外切酶活性对于单链 DNA 要比双链 DNA 活性更高，即单链 DNA 要比双链 DNA 中的非配对链部分更容易被 T4 DNA Polym
2、erase 所消化。T4 DNA Polymerase 的 35 外切酶活性比 Klenow Fragment 要高约 200 倍。用途：T4 DNA Polymerase 可用于催化以下反应：DNA 5或 3突出末端的平滑化；通过置换反应进行标记 DNA 探针合成；定点突变过程中第二链的合成；不依赖于连接反应的PCR 产物克隆。来源：本 T4 DNA Ligase 由大肠杆菌表达，表达基因的来源为 T4 嗜菌体。活性定义：3730 分钟时间内，催化 10nmol 脱氧核糖核苷酸 (dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为 1 个活性单位。活性检测条件：67mM Tris-HCl(pH8
3、.8)，6.7mM MgCl2，1mM DTT，16.7mM(NH 4)2SO4，0.2mg/ml BSA，0.033mM of each dNTP，0.4MBq/ml 3H-dTTP，0.2mM 热变性且经DNA 酶部分消化过的小牛胸腺 DNA。纯度：不含 DNA 内切酶，不含 RNase。酶储存溶液：20mM potassium phosphate(pH7.5)，200mM KCl，2mM DTT，and 50% glycerol。Reaction Buffer(5X)：335mM Tris-HCl(pH8.8 at 25)，33mM MgCl2， 5mM DTT，84mM(NH4)2SO
4、4。缓冲液兼容性：在碧云天的内切酶反应缓冲液 1X O、1X R、1X Y、2X Y 中的活性为100%，在 1X B、1X G 中的活性为 75-100%。失活或抑制：70加热 10 分钟可使 T4 DNA Polymerase 失活。金属离子螯合剂可以抑制T4 DNA Polymerase 的活性。T4 Polynucleotide Kinase，简称 T4 PNK，中文名称 T4 多聚核苷酸激酶，是一种多聚核苷酸 5羟基激酶，可以催化 ATP 的 位磷酸基团向单链或双链 DNA、RNA、寡核苷酸或带有 3磷酸基团的单核苷酸的 5羟基转移。其他 NTP 也可产生相同的反应：5-OH + N
5、TP 5-P + NDP。上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失 ATP 并且存在 ADP 的情况下，T4 Polynucleotide Kinase 可以显示出 5磷酸酯酶的活性，催化单链或双链 DNA、RNA、寡核苷酸或带有 3磷酸基团的单核苷酸的 5磷酸基团向 ADP 的转移形成 ATP。其他 NTP 也可产生相同的反应：5-P + NDP 5-OH + NTP(最适 pH 为 6.4 左右) 。当 ATP 和 ADP 都适量存在时，T4 Polynucleotide Kinase 可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有 3磷酸基团的单核苷酸的 5磷酸基团和 ATP 的 位磷酸基团之
6、间的交换反应。其他 NTP 也可产生相同的反应：5-P + NTP + NDP5-P + NDP + NTP。T4 Polynucleotide Kinase 同时具有 3磷酸酯酶活性，可催化 3磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3-P 3-OH + Pi(最适 pH 为 5.9 左右) 。T4 Polynucleotide Kinase 的激酶活性在 C-末端附近，而磷酸酯酶活性在 N-末端附近。用途：寡核苷酸、DNA 或 RNA 的 5末端标记，用作 Southern、Northern 、EMSA 等的探针，凝胶电泳的 marker，DNA 测序引物，PCR 引物等；使寡核苷酸、DNA 或 R
7、NA 的 5端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化 3磷酸化的单核苷酸的 5磷酸化，使该单核苷酸可以和 DNA 或 RNA 的 3末端连接；去除 3端磷酸基团。来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为 T4 嗜菌体。活性定义：3730 分钟内，将转移 ATP 上 1 nmol -磷酸基团转移到 DNA 5-OH 末端所需的酶量定义为 1 个活性单位。酶活性检测条件：100mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgCl2，5mM DTT，0.5mM 5-OH DNA，0.05mM ATP，0.1MBq/ml - 33P-ATP。纯度：不含 DNA 内切酶和外切酶，不含 RNA 酶。酶储
8、存溶液：20mM Tris-HCl(pH7.5)，25mM KCl，0.1mM EDTA，2mM DTT，50% glycerol。Reaction Buffer A(10X)(用于磷酸化反应) ：500mM Tris-HCl(pH7.6 at 25)，100mM MgCl2，50mM DTT，1mM spermidine，1mM EDTA。Reaction Buffer B(10X)(用于交换反应 )：500mM imidazole-HCl(pH6.4 at 25) ，0.18M MgCl2，50mM DTT，1mM spermidine，1mM EDTA，1mM ADP。缓冲液兼容性：在碧
9、云天的内切酶反应缓冲液 1X G、 1X O、1X Y、2X Y 中的活性为100%，在 1X B、1X R 中的活性为 75-100%；在碧云天的 Taq、Pfu DNA polymerase 和 M-MuLV 反应缓冲液中的活性为 50-100%。失活或抑制：75加热 10 分钟可使 T4 Polynucleotide Kinase 失活，加入 EDTA 也可使T4 Polynucleotide Kinase 失活。金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于 50mM 的 KCl和 NaCl 均可显著抑制 T4 Polynucleotide Kinase 的活性。Klenow Fragment
10、，又称 Klenow 片段，是大肠杆菌聚合酶 I(E.coli.DNA polymerase I)的大片断(Large Fragment)。Klenow Fragment 保留了 DNA 聚合酶 I 的 53聚合酶活性和 35外切酶活性，但缺少完整的 Klenow 酶的 53外切酶活性。 Klenow Fragment 的 35 外切酶活性保证了其合成 DNA 时的准确性(proofreading)。特点：对于 5突出或 3突出的粘末端都可以催化产生平末端，用于后续的平端连接。用途：双链 DNA 5突出(5overhang)末端的补平(fill-in)；双链 DNA 3突出(3overhang
11、)的打平(也称削平)；5突出末端的标记；随机引物法进行 DNA 标记；Sanger 双脱氧法进行DNA 测序；cDNA 第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。 来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为 polA 基因片段。分子量：约 68kDa(单体)。活性定义：3730 分钟时间内，催化 10nmol 脱氧核糖核苷酸 (dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为 1 个活性单位。酶活性检测条件：67mM potassium phosphate(pH7.4)，6.7mM MgCl2，1mM 2-mercaptoethanol，0.033mM dATP，0.033mM dTTP，0.4MBq
12、/ml 3H-dTTP，62.5g/ml poly(dA-dT)poly(dA-dT)。纯度：不含 DNA 内切酶，不含 RNase。酶储存溶液：25mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1mM EDTA，1mM DTT，50%(v/v)glycerol。Reaction Buffer(10X)：500mM Tris-HCl(pH8.0 at 25)，50mM MgCl 2，10mM DTT。缓冲液兼容性：在碧云天的内切酶反应缓冲液 1X O、1X R、1X Y、2X Y 中的活性为100%，在 1X B、1X G 中的活性为 100%；在碧云天的 Taq、Pfu DNA polymera
13、se 和 M-MuLV 反应缓冲液中的活性为 100%。失活或抑制：75加热 10 分钟或加入适量 EDTA 均可导致 Klenow Fragment 失活。金属离子螯合剂，无机焦磷酸盐(PPi)，大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对 Klenow Fragment 有抑制作用。Klenow Fragment (3 5 exo)用随机引物制备探针随机引物标记法合成 cDNA 第二链诱变反应中第二链的合成（ 2）双脱氧法 DNA 序列测定（ Sanger 法）（ 3）概述：Klenow 片段 (35exo - )是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物。同大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 一样，具有
14、 53 的 DNA 聚合酶活性，但失去了 53 外切核酸酶活性。该酶经突变(D355A, E357A) 去除了其35的外 切核酸酶活性 (1) 。来源：重组 E. coli 菌株，其携带的质粒上含有 E. colipolA（D355A，E357A ）基因的片段，片段起始位置在密码子 324 处。反应条件：1X NEBuffer 2 50 mM NaCl， 10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT （pH 7.9 25 ）。加入 dNTPs（不随酶提供）。当添加 dNTPs 后， Klenow 片段（ 3 5 exo-）在所有的 NEB 限制性内切酶反应缓冲液中都有
15、活性单位定义：1 单位指在 37C 条件下，30 分钟内能使 10 nmol 的 dNTPs 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。热失活：75C 20 分钟。使用注意事项：Klenow 片段 (35exo -)因去除了 35外切酶的活性，故不适宜用于生成平末端的反应。当用于双脱氧法 DNA 序列测定时(Sanger 法) (2) ，建议用 1 unit/5 l 反应体系。T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶，可以催化粘端或平端双链 DNA 或 RNA 的 5-P 末端和3-OH 末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需 ATP 作为辅助因子。同时 T4 DNA 连接酶可以修补双链 D
16、NA、双链 RNA 或 DNA/RNA 杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。用途：T4 DNA Ligase 常用于 DNA 片段和载体、linker 或 adaptor 等的连接。也可以用于缺刻修复及 Ligase 介导的 RNA 检测。来源：本 T4 DNA Ligase 由大肠杆菌表达，表达基因的来源为 T4 嗜菌体。活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16 in 20 l of th
