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1、1凋亡调节因子与药物耐受性肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是临床化疗失败的重要原因。本文综述细胞凋亡调节因子 p53、bcl-2 、bax 等对肿瘤细胞耐药机制的影响和 p53 蛋白等对 P 一糖蛋白和多药耐药相关蛋白表达的调节作用，并介绍部分多耐药性新的研究进展。 放疗和化疗对肿瘤细胞有明显杀伤作用。然而成功治疗的一个重要障碍是肿瘤细胞对上述治疗无反应，并出现耐受细胞群，导致恶性肿瘤复发或浸润进展。因此了解细胞对化疗药物耐受基础成为许多实验研究的热点。一般而言，研究的重点是解释治疗因子怎样达到细胞内靶位点，并检查药物与靶位点相互作用的分子基础，如高水平表达 MDRI 基因能够限制多种药物在细胞内的
2、浓度，并引起多耐药性（MDR ） 。 最近几年里，探索和了解细胞凋亡机制，对肿瘤细胞获得或失去耐受细胞毒性机制有了新的认识。 1 凋亡调节因子对耐药性的调节作用 2许多药物能诱导细胞凋亡，包括抗代谢药、脱氧核苷酸合成抑制剂、DNA 拓扑异构酶抑制剂、烷化剂及干扰微管药物等1。化疗药物引起凋亡的过程还不十分清楚，可能是药物打断了正常的细胞生长周期所致2。凋亡是一种可以被激活或抑制的可调节过程，因此可能还有在某些情况下药物耐受性的新解释。 1.1 p53 野生型 p53（wt-p53）在细胞生长过程中以 “分子警察”身份监视细胞内 DNA 状态，当 DNA 受损后，p53 通过转录后稳定机制抑制细
3、胞停留在 G1 期，使细胞有时间修复，若修复失败，wt-p53 将角发细胞凋亡。wt-p53 缺乏或发生突变，将失去“分子警察”作用，不能诱导受损细胞凋亡，而使受损细胞得以生存。但由于细胞失 G1 期细胞周期检查点的 DNA 损伤监视作用，易造成诸如缺失、扩增和易位等染色体畸变。 Malcomson3采用温控 p53 表达载体转染鼠胚胎成纤维细3胞株，在鬼臼乙叉甙（VP-16）作用下，32条件时，wt-p53 表达，细胞滞留在 G1 期，明显表现出对药物介导凋亡的耐受性；而在 37时，表达突变型 p53，细胞在 VP-16 作用下，无明显生长抑制，继续增殖，并显示出剂量依赖性的细胞凋亡增多。提
4、示 wt-p53 能介导细胞对 VP-16 的耐受性。wt-p53 介导的耐药性可能与药物作用特点有关。VP-16 为细胞周期特异性药，主要作用于细胞周期的 S 期，干扰 DNA 的合成。一定剂量的 VP-16 作用细胞后，wt-p53 使得细胞滞留在 G1 期而不继续增殖，因此， VP-16 作用的靶位点减少，如同 Topo酶含量下降介导的耐药性一样，引起细胞对 VP-16 的耐药性。 Wosikowski4检测 13 例对阿霉素（ADM） 、长春花碱、顺铂（CDDP） 、VP-16 和胺苯丫啶等耐药的乳腺癌细胞株，仅 1 例发生 p53 基因突变。 但许多学者认为低浓度化疗药物可引起表达
5、wt-p53 的细胞凋亡，在缺乏 wt-妇生基因突变后，须大剂量药物方能引起细胞死亡5、wt-p53 的缺失或突变间接导致了药物耐受性。Lowe6通过体内实验发现，表达 Wt-p53 基因的肿瘤细胞在经 放射性和ADM 治疗后，绝大多数细胞发生凋亡；相反，相同因子治疗 p53基因缺陷的肿瘤细胞 MEFS，对放疗和几种化疗药物有较强的耐药性。但将 wt-p53 基因转染到 MEFS 细胞，低剂量放疗，或小剂量的 ADM、VP-16 等药物处理后细胞迅速凋亡。另有报道 wt-p534能促进体外培养的人粘液表皮样癌细胞凋亡。 p53 对细胞耐药性的调节可能是双向的，具体作用方式可能与细胞种类、状态及
6、药物作用特点和剂量有关。如突变型 p53 可能更多引起细胞对细胞周期非特异性药物耐受，而 wt-p53 介导细胞对某些细胞周期异性药物耐受。 1.2 Bcl-2 家族 一些研究发现 bcl-2 基因家族蛋白表达水平变化，能显著改变肿瘤细胞株对化疗药物诱导凋亡的阻抗。Dole7 用 bcl-2 表达载体转染人类神经母细胞瘤细胞株 Shep-1，发现高表达 bcl-2 克隆的细胞株对 CDDP 和 VP-16 引起的细胞毒性呈剂量依赖性阻抗。Miyashita1采用基因转染方法，发现 bcl-2 能使细胞增加对地塞米松、氨甲喋呤、阿糖胞苷、长春新碱（VCR） 、VP-16 和 CDDP等药物耐受性
7、。与对照组细胞相比， bcl-2 蛋白并不影响药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，但在维持细胞存活中起着重要调节作用。在 VP-16 和 CDDP 等化疗药物去除后，bcl-2 蛋白能够重新启动细胞增殖，使细胞获得耐药性。 5Pantazis8研究 VCR 诱导人白血病细胞株 U-937/WT 形成VCR 耐药细胞亚株 U-937/RV，在 U-937/WT 细胞中不能检出凋亡抑制蛋白 bcl-2 和 bcl-xl 表达，而在 U-9377/RV 均可检出；但在U-937/RV 中亦可检出 bax 蛋白表达，后者是一种凋亡启动因子，是一种 bcl-2 蛋白的异源二聚体，可抵销 bcl-2 的活性作用
8、，而在敏感株中未检出 bax 蛋白。由此可见 bcl-2 家族在细胞耐药过程中的作用也是相互调节和相互制约的。 1.3 p53 与 bcl-2 家庭间的相互影响 细胞凋亡是一个多因子参加的复杂的生理过程，药物影响能诱发 p53 和 bcl-2 等蛋白发生一系列变化，参与细胞的耐药性。 Miyashi9研究发现 wt-p53 能与 bcl-2 基因上 p53 依赖性的负反应元件结合抑制 bcl-2 的表达。Eliopoulos10检测 p53 和bcl-2 蛋白在敏感和耐药的卵巢癌细胞株中表达水平，结果显示耐药株过度表达 p53 和 bcl-2 蛋白，且 bcl-2 作用环节可能在 p53 之6
9、上。许多临床资料亦发现突变型 p53 和 bcl-2 蛋白的高表达与不良预后有关。 Ju11将 wt-p53 传染 wt-p53 阴性的 HL-60 细胞形成转染株 SN3，与母代细胞相比，对化疗药物的敏感性明显增加，如对CDDP 和胸苷（thymidine）的敏感性分别增加 2 倍和 50 倍；而用突变型 p53 传染的细胞无比现象。用胸苷合成酶抑制剂 FdUrd 观察与 p53 相关联基因表达变化，在各种浓度的 FdUrd 存在下，很大比例的 SN3 细胞发生凋亡，而不是停留在 S 期。母代细胞有不确定的 bax 水平和高水平的 bcl-2 表达。在 SN3 细胞 bcl-2 检测不出，并
10、维持适当基础水平的 bax。FdUrd 治疗后， wt-p53 和 bax 水平增加，但 bax 诱导早于 p53，且平行出现细胞凋亡的 DNA 条带。Perego12检测 p53 与顺铂导致耐药性间的关系时，发现在卵巢癌药细胞株中，突变型 p53 失去激活 bax 基因转录能力。 这些资料说明 p53、bax-2 和 bax 等凋亡调节因子在肿瘤细胞的耐药机制中起重要作用，但作用方式是复杂多样的。 2 p53 对耐药蛋白的调节作用 7p53 具有不同结构区域。wt-p53 与 DNA 共有区结合后，能正向调节一系列下游基因的表达。另外，wt-姢负向调节许多缺乏wt-p53 共有区结合位点基因
11、，包括 DNA topo、MDRI、c-fos和其它病毒和细胞的启动子。 2.1 p53 对多药耐药相关蛋白（ MRP）表达的调节 转录因子 spl 是 MRP 基因启动子的强激动剂， wt-姢与 spl结合，消除 spl 作用，从转录水平调节 MRP 表达。Wang13 将带有虫荧光素酶标记报告基因的 MRP 启动子与 wt-p53 共同转染p53 阴性的人类非小细胞肺癌细胞株 H1299 和鼠（10）1 细胞，结果显示 wt-p53 能呈剂量依赖性地显著抑制 MRP 启动子活性，wt-忍气吞声作用位点为-91 到+103bp ，该处有数个 spl 结合位点；而突为型 p53 只有很弱的作用
12、。同时研究还发现 wt-p53 还能抑制高表达 MRP 的 CEM/VM-1-5 细胞的内源性 MRP 表达。Oshika14采用免疫组化技术检测 107 例非小细胞肺癌标本，MRP和突变型 p53 表达有明显相关性，双染色技术显示 p53 和 MRP 在一些细胞上同时表达，这些病人预后明显罗无 MRP 和突变型 p538患者差。 2.2 p53CF p-糖蛋白（P-gp ）表达的调节 P-gp 是有 MDR1 基因编码的多药耐药蛋白。wt-作用于MDR1 下游启动子，从转录水平 P-gp 的表达。Straussp15将wt-p53 与由 MDR1 下游启动子控制的报告分子共同转染 BHK 和
13、Sacs-2 细胞株，发现 wt-p53 呈剂量依赖性 MDR1 基因启动子活性。Strauss16在另一 研究中发现部分 p53 的突变体能激活MDR2 基因下游启动子转录活恪，他将这种 p53 突变称为“获得功能性突变” 。Linn17采用双重免疫组化染色，核 p53 聚集和 P-gp表达经常发生在同一肿瘤细胞，且这种情况在浸润进展期的乳腺癌中更易见到。其推测共同表达突变型 p53 和 P-gp 属于一系列分子事件，能导致肿瘤浸润、药物耐受，产生不良预后。 3 其它凋亡调节因子对耐药蛋白的调节作用 Bcl-2 与 P-gp 作用尚不明确，但 Eid20采用免疫组化分析970 例人睾丸肿瘤
14、Bcl-2 和 P-gp 表达，Bcl0-2 和 P-gp 存在明显的相关性（P=0.004） 。 C-myc 癌基因为一种参与细胞分化和恶性增殖的核蛋白型癌基因，具有促使 DNA 复制的功能，可在一些致癌因素作用下（如病毒、放射性和化学诱变剂）发生基因重排和扩增而得以活化。C-myc 基因表达既可促进细胞增殖又可促使细胞凋亡，这种相互对立的作用受生长因子等调控。 C-myc 与 P-gp 的关系还不清楚，但有报告采用 Southern印记杂交分析，发现同一恶性脑胶质瘤细胞发生 C-myc 基因重排及MDR1 基因限制性片段扩增现象，推测 C-myc 基因活性 MDR1 基因的变化和脑胶质瘤耐
15、药株的耐药性可能存在较为密切的关系。但另一作者采用免疫组化方法研究 67 例胃癌标本中 p53、C-myc 和P-gp 的表达，P53 的异常表达与 P-gp 表达呈显著正相关（r-0.63,P0.05 ）,C-myc 和 P-gp 的表达无明显相关。 N-myc 也编码一个调节转录的核酸化蛋白。N-myc 基因的扩增与 MRP 表达增加有关。Bordow19采用 Rt-PCR 观察 25 例10神经母细胞瘤标本，N-myc 基因扩增的标本，MRP 基因表达水平亦明显增高（P=0.0016） ，而 MDR1 基因表达与 N-myc 癌基因扩增无明显关系。采用 N-myc 癌基因抑制剂 RA 研
16、究神经母细胞瘤细胞株 SH-SYSY 和 BE（2）-C，RA 抑制 N-myc 基因表达后，MRP表达随之下降（P-=0.0017） ，而 MDR1 基因表达量却增加（P 0.05） 。Norris20 分析 60 例原发性神经母细胞瘤标本，亦发现在 N-myc 扩增的肿瘤，MRP 表达水平明显增（P0.001） 。 Kopnin2分析人 ras 基因对 MDR1mRNA 和 P-gp 表达影响。ras 基因除能激活外源性 MDR1 基因启动子外，还能引起内源性 MDR1mRNA 水平升高，P-gp 活性增加并使 Rhodamine123外排增多，细胞对秋水仙素和其它一些化疗药物的耐药性亦增加。Chin22研究发现人 MDR1 基因启动子也是 ras 癌基因的靶位点，虽然其产物对 MDR1 基因的正向调节是非特异的，但与突变型 p53有协同作用，而 wt-p53 无此作用。
