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1、1凋亡抑制蛋白 survivin 的研究进展【关键词】 肿瘤【关键词】 凋亡；抑制蛋白；肿瘤0 引言Survivin 是新近发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族的一员. 在大部分正常分化组织中检测不到而在发育中的胚胎组织和快速分裂细胞中高表达1, 在多种恶性肿瘤组织中呈高表达，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、子宫内膜癌、神经纤维瘤和淋巴瘤. 这一特点使它受到人们广泛关注. 已成为分子肿瘤学的一个热点.1 细胞凋亡1.1 分子生物学特征 Survivin 基因定位于 17q25，可引起 3种选择性剪切，其中野生型具有 3
2、 个内含子， 4 个外显子. 其他两个剪切体分别是选择性外显子 2 的插入（survivin2B）和外显子 3 的移除(survivinEx3) 2. Survivin 基因编码 142 个氨基酸，分子质量为 16.5 ku，是 IAP 家族中最小的一员， IAP 家族构成了一个2高度保守的基因家族，这个家族的蛋白成员能抑制由多种刺激引起的凋亡，其首先在杆状病毒中被确认. IAP 的同源物已在哺乳动物中发现，由不同种属获得的 IAP 都有相同的结构即杆状病毒 IAP 重复序列（BIR） ，IAP 家族蛋白的特点是具有一个或几个 BIR 区域，这70 个残基通常作为细胞死亡蛋白酶的抑制剂，IAP
3、 通常还包括一个CASPASE 募集区域(Caspaserecruiting domain, CARD）和一个环指状区域(ring finger). 但 survivin 只包含一个 BIR 区域,无环指状区域和其他区域. Survivin 蛋白以一种细胞周期依赖的方式表达于G2/M 期，在有丝分裂中定位于微管组织中心（microtubule organizing centers, MTOC） 1 ，为了阐明其细胞周期依赖表达的机制，有学者已对鼠 survivin (msurvivin)人 survivin 同系物的启动区做了相关研究， msurvivin 基因的 5末端包含一个 TATA 稀
4、有的启动子，2 个 AP2 位点，3 个 NFKB 位点，一个 SP1 位点，多个细胞周期依赖元件（CDEs）和一个细胞周期基因同源区（CHR）. 引物延伸和 cDNA 5端快速放大实验证实，在 ATG 起始密码子的上游 100 个碱基处有一个转录其始位点. Msurvivin 启动区荧光素酶分析也证实了在临近 ATG 起始密码子上游 271 个碱基处存在一个最小启动区，并且从-410-272 的区域对于增强子的活性是至关重要的. 位于 -51 处的 CHR 和位于-57 处的 CDE 的联合对于细胞周期依赖表达也是至关重要的. CDE/CHR 和增强子的突变可能引起msurvivin 的表达
5、紊乱从而影响细胞存活进而导致肿瘤发生. 然而，蛋白稳定性的改变也有利于 survivin 聚集于 G2/M 期，据此业已证3实在有丝分裂间期 survivin 的多泛素化和蛋白酶样依赖性结构破坏. 并且证实在有丝分裂期 survivin 的 Thr34 的磷酸化与蛋白稳定性的增加有关2.1.2 抗凋亡机制凋亡被认为是细胞自杀的一种基因程序. 哺乳动物的凋亡涉及两条主要途径，一条是外源性途径，这条途径对于免疫调节和炎症反应至关重要，由细胞表面三聚体死亡受体启动，包括 TNF 受体和 CD95（FAS）. 另一条是内源性通路，由细胞内和环境因素所启动，集中于线粒体功能的失调. 外源性和内源性通路分
6、别通过 Caspase8 和 Caspase9 发挥其凋亡功能，但最终都聚集于效应 Caspase 分子，由其作用于死亡底物引起凋亡. 目前已阐明的调节凋亡的两个基因家族是：BCL2 和 IAP 家族. IAP 是通过抑制内源性 Caspase 的活性而抵抗凋亡的3 . IAP 作用于 BCL2 引起凋亡的下游 Caspase9 分子，抑制其从凋亡复合体中释放，凋亡复合体是一个能激活 Caspase 的超分子复合物，包括细胞色素 C，凋亡激活因子 1（APAF1）和 Caspase9 前体分子，从而抑制效应CASPASE 分子的激活. Survivin 的抗凋亡作用已在体内阐明. 在皮肤基底层
7、细胞应用转基因技术表达 survivin 并不影响角化细胞的分化或增生，但阻断射线诱导的凋亡. 使用反义 survivin 或 C84A 突变体，结果导致自发凋亡，Caspase 活性的增加和细胞增生的抑制. 每一种 IAP 抑制 Caspase3 的能力不相同，依次为XIAPCIAP2CIAP1survivin. 同样的顺序在哺乳动物4细胞中也得到证实2.1.3 亚细胞定位及细胞增殖随着细胞周期的运动，survivin 基因的表达及亚细胞定位也发生相应的改变. 研究证实, survivin 的表达在 Hela 细胞 G1 期检测不到，在 S 期升高 6.2 倍，在 G2/M 期升高 40 倍
8、. 在分裂间期期 survivin 定位于动粒，前期定位于中心粒，中期定位于纺锤体微管，后期定位于中央纺锤体中间带，末期定位于赤道板1. Survivin 蛋白的表达调控与亚细胞定位提示survivin 可能使细胞周期顺利进行. 应用反义 RNA 技术，反义survivin 除了引起自发凋亡外，还引起异常的有丝分裂表型的出现，其特点是多个中心体、多极有丝分裂纺锤体的形成、胞质移动障碍和多核细胞的形成.2 恶性肿瘤2.1 食管癌应用实时定量 RTPCR 法检测食管癌中 survivin mRNA 表达水平 . 结果提示与正常食管组织相比食管癌中 survivin mRNA 表达水平显著提高（P0
9、.05 ）. 原位杂交也证实了这一结果，并且显示阳性信号主要定位在细胞质. 中、低分化癌组织中survivin 表达水平显著高于高分化癌组织（P0.05）. 采用TUNEL 法检测 survivin 表达与凋亡的相关性，得到 survivin 表达与凋亡细胞数之间呈负相关性（P0.05） 4 . Grabowski 等55应用免疫组化法检测 84 例食管鳞状细胞癌,其中核表达 67 例(80%)，本组中位生存期为 28(2036) mo，显著短于无核表达的患者, 108 (62154) mo, P=0.003. 单变量分析显示 survivin 核表达，肿瘤深度，淋巴结转移都与生存期显著相关，
10、而胞质表达 53例占 63%，没有预后意义. 提示核 survivin 的表达可成为食管鳞状细胞癌个体化治疗的一个参考指标.2.2 肝细胞肝癌 Ikeguchi 等6应用 RTPCR 法检测survivin mRNA 在 51 例 HCC，51 例癌旁肝组织和 6 例正常肝组织中的表达. 应用多克隆兔抗人抗单链 DNA 抗体检测凋亡细胞的表达. 结果肝癌组织，癌旁肝组织和正常肝组织 survivin mRNA 的表达率分别是 41%，4%. 正常肝癌组织未见表达. Survivin mRNA 在癌组织中的表达与肿瘤大小，分期无关. 30 例 survivin mRNA 表达阴性的肝癌组织其凋亡
11、细胞百分比(5.23.4)%显著高于 21 例表达阳性者(2.22.3)% (P=0.0019)，其 5 a 疾病缓解生存率（39%）显著长于表达阳性者（19%， P=0.0184）.Survivin 在其他肿瘤中的阳性表达率依次为：胰腺癌 80%7 ，鳞状细胞癌（皮肤鳞癌和口腔鳞癌）60%8 ，胃癌 82%9 ，乳腺癌 60%10 ，卵巢癌 74%11.2.3 血管生成肿瘤血管生成源于局部组织内血管刺激因子与抑制因子平衡的失调，已阐明的刺激因子有成纤维细胞生长因子（FGF） ，血管生成素 1（ang1）和血管内皮细胞生长因子6（VEGF）也称为血管通透因子（VPF ）. VEGF 在大多数人
12、和动物肿瘤中高表达，不仅表达于肿瘤细胞本身，而且至少在部分肿瘤侵润正常基质细胞也表达. 先前的研究证实 VEGF 是一个促有丝分裂发生素，然而，最近的研究表明 VEGF 在新形成的、不成熟的血管内皮细胞中作为主要的生存因子（抗凋亡）而发挥作用. 抗凋亡功能及血管通透性的改变现在被认为是 VEGF 的促血管生成的主要方式. 有研究报道 VEGF 能保护新形成的不成熟的肿瘤血管内皮细胞. 由此引发人们对 VEGF 如何在内皮细胞调节其抗凋亡作用的兴趣. 由于 IAP 蛋白的抗凋亡功能，最近的研究表明 XIAP 能被诱导表达于内皮细胞中，保护他们免受肿瘤坏死因子（TNF）诱导的凋亡. Jennife
13、r 等研究表明 VEGF 在人脐静脉血管内皮细胞中上调 IAP 蛋白的表达. 这个结果引起了人们的广泛关注，因为人 survivin 不表达于非转化细胞. 这一结果提示 survivn 的靶向治疗能导致血管生成的抑制. 因此，由于在肿瘤细胞和血管内皮中均高表达， survivin 成为一个有潜力的癌症靶向治疗靶点.2.4 癌的靶向治疗 Survivin 的靶向治疗基于以下两方面考虑：选择性表达于肿瘤细胞，与癌的生存能力息息相关. 通过仔细研究survivin 的功能，发现由有丝分裂激酶 p34cdc2cyclinB1 诱导的磷酸化对于其功能是必须的. 由此引出通过干预 Thr34 磷酸化而达到
14、治疗目的. 有研究应用磷酸化缺陷型 survivin，Thr34Ala 突变（survivinT34A） ，结果导致 survivinCaspase9 复合体从有丝分裂7装置上分裂和促使 Caspase9 凋亡通路的形成. Survivin(T34A)的抗癌特性最近已在骨髓瘤异种移植体合并严重免疫缺陷小鼠的前临床试验中证实，survivin(T34A)的表达抑制骨髓瘤的形成和抑制已存在肿瘤的生长. 为了使其更方便易得，一个编码 survivin(T34A)的复制缺陷性腺病毒（pAdT34A）应运而生. PAdT34A 应用在各种癌细胞中促使 Caspase 依赖的凋亡，对正常细胞没有毒性. 最
15、后，survivin 之所以能作为一个较好的抗癌靶点还因为其在肿瘤血管生成方面起着重要作用. 在静止的内皮细胞中检测不到，但在受血管生成因素刺激的内皮细胞中强烈表达. 在血管生成期应用反义survivin 技术，结果血管内皮生长因子的细胞保护效应随即消失，内皮细胞凋亡. 因为肿瘤血管生成严格依赖内皮细胞生存能力，因此靶向 survivin 的治疗有利于已形成血管的凋亡退化从而间接抑制肿瘤生长1.随着 survivin 通路的进一步阐明，对于其凋亡抑制和细胞分化功能可能更加明了，随之，更多的方法将应用于分子诊断和干预治疗.【参考文献】1 Altieri DC. The molecular bas
16、is and potential role of survivin in cancer diagnosis and therapy J. Trends Mol Med, 2001;7(12): 542-547.82 Altieri DC. Validating survivin as a cancer therapeutic target J. Nature, 2003；3:46-49.3 杜红俊, 惠延年, 王雨生, 等. Caspase3 在柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡中作用J. 第四军医大学学报, 2001;22(7):609-611.4 Takizawa T, Kitagawa M, Hasegawa M, et al. Expression of IAP family proteins in esophageal cancer J. Exp
