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1、1兔缺血心肌中移植自体骨髓基质干细胞的治疗作用【关键词】 缺血心肌Autologous marrow stromal cell transplantation for improving rabbit cardiac performance after myocardial infarction【Abstract】 AIM: To test the hypothesis that marrow stromal cells (MSCs), when implanted into selfmyocardium, can undergo milieudependent differentiation
2、, express cardiomyogenic phenotypes and enhance angiogenesis and cardiac function of ischemic hearts in vivo. METHODS: Acute myocardial infarction was induced by occlusion of left anterior descending artery, and autologous MSCs labeled with BrdU (Bromodeoxyuridine) in vitro were administrated intram
3、yocardially into the infarct area of the same donor rabbits. RESULTS: After 4 weeks, transplanted MSCs demonstrated myogenic differentiation with the expression of sarcomeric actin and connexin 43. MSCs displayed increased levels of VEGF protein (68486) fg/L vs (51551) fg/L, P0.05 and the number of
4、vessels (22.96.6)/HP 2vs (19.05.9)/HP, P0.05 in myocardial ischemia area, compared with those in controls. MSCs implantation resulted in markedly improved left ventricular contractility LVSP: (15.080.84) kPa vs (13.260.68) kPa; LVEDP: (1.530.28) kPa vs (19.030.41) kPa; +dp/dtmax: (+615.7748.69) kPa/
5、s vs (+435.7558.25) kPa/s; -dp/dtmax: (-401.1746.23) kPa/s vs (-338.2550.72) kPa/s, P0.05. CONCLUSION: Autologous MSCs transplantation can effectively treat myocardial ischemia without immune rejection.【Keywords】 marrow stromal cell； ischemic myocardium； transplantation【摘要】 目的：验证骨髓基质干细胞（MSC）移植到缺血心肌中
6、后是否在心肌的微环境中可以向心肌细胞分化，提高心功能. 方法：采用自体 MSC 体外培养扩增移植. 在通过结扎冠状动脉造成急性心肌缺血后，被 5 溴 2 脱氧尿苷（BrdU）标记后的 MSC 移植到自体的缺血心肌中. 结果：移植 4 wk 后，MSC 向肌细胞分化，表达出 横纹肌肌动蛋白（sarcomeric actin）和存在于闰盘中的connexin 43，移植后心肌表达 VEGF 增加(68486) fg/L vs (51551） fg/L，P0.05 ，缺血心肌局部血管密度增加(22.96.6)/HP vs (19.05.9)/HP，P0.05 ，左室收缩功能3明显强于对照组LVSP:
7、 （15.080.84 ）kPa vs （13.260.68） kPa; LVEDP: （1.530.28）kPa vs（ 19.030.41） kPa; +dp/dtmax: （+615.7748.69）kPa/s vs （+435.7558.25 ）kPa/s; -dp/dtmax: （-401.1746.23） kPa/s vs （-338.2550.72） kPa/s, P0.05. 结论：MSC 移植可治疗心肌缺血，并且没有免疫排斥反应.【关键词】 骨髓基质干细胞；缺血心肌；移植0 引言在离体实验中发现骨髓基质干细胞（marrow stromal cells，MSC ）可以被 5 杂
8、氮胞苷诱导为心肌细胞 1. 由于自体MSC 容易被获取，而且具有较强的增殖能力，自体 MSC 应用于临床可以不再需要胚胎组织和应用免疫抑制剂，因此较其他来源的供体细胞更有优势. 为了同未来的临床实践相吻合，我们应用自体MSC 移植入缺血心肌中，而没有用被诱导后的 MSC. 目的是着重探讨移植后 MSC 特异性蛋白的变化及其对与心功能的影响.1 材料和方法1.1 材料4取健康雄性的新西兰兔(2.53.5) kg（浙江大学医学院动物实验中心） ，经耳缘 iv 戊巴比妥纳（30 mg/kg）麻醉，用骨髓穿刺针无菌抽取骨髓，Percoll 细胞分离液分离细胞，接种于培养瓶中，培养液用含 200 mL/
9、L 胎牛血清的完全 LDMEM（2 mmol/L L 谷氨酰胺，1104 U/L 青霉素和 25 g/L 两性霉素） ，37 ，50 mL/L CO2 孵箱静置培养. 抽取的每个动物的骨髓基质干细胞及每个动物均进行编号. 取传第 2 代的 MSC 于移植前 24 h 用 BrdU(5 溴 2 脱氧尿苷, Sigma)标记骨髓基质干细胞，10 L BrdU 贮液(BrdU, 50 mg; 二甲基亚砜 0.8 mL; 三蒸水 1.2 mL)加入 5 mL 完全培养液中. 移植前用 PBS 调整细胞密度为 11011/L. 标记细胞的检测（免疫组化）：先加 2 mol/L 盐酸（室温，50 min）
10、 ，正常山羊血清封闭10 min，不洗，甩掉，加含 3 g/L Triton X100 的 140 鼠抗Brdu mAb（抗体稀释液稀释） ，加入生物素标记的羊抗鼠抗体（室温 80 min） ，加入 SABC 复合物室温 50 min，DAB 显色，脱水、透明、封片.1.2 方法30 g/L 的戊巴比妥钠（30 mg/kg）经耳缘 iv 麻醉. 心电图导联线与兔四肢相连接入八道生理记录仪之心电图放大器（AC601G）记录标准导联心电图. 在胸骨左缘胸肋关节处剪断5，肋骨开胸，剪开心包膜，用小拉钩将心包膜固定于胸壁，充分暴露心脏. 用眼科小圆针在冠状动脉左室支主干中上 1/3 处结扎，心电图导联
11、上出现 ST 段弓背样抬高为结扎成功 . 生存的 13动物被随机分为 2 组，实验组（ M 组，n1=7）于心肌梗死前后缘上、中、下各 3 点分别注射自体 MSC 11011/L，对照组（C 组，n2=6）注射同等数量的 PBS. 4 wk 后重返实验室，麻醉方法同前 . 先行心脏彩超检查，测量左室后壁运动幅度、左室收缩期室壁增厚率及射血分数，而后分离颈动脉行左心室插管，左心室插管经三通接八道生理记录仪之载波放大器，记录左心室压力曲线，左心室压力微分曲线，记录左心室舒张末压（LVEDP） 、左心室收缩压（LVSP）左心室压力微分（dp/dt）： 曲线及左室压正负变化最大速率（dp/dtmax）
12、 .1.2.1 移植 MSC 向心肌细胞分化的检测测量完毕后，取心肌梗死区的组织进行冰冻切片，行免疫荧光双标法染色确定移植骨髓基质干细胞向心肌细胞分化. 免疫荧光双标法：切片加 2 mol/L HCl中 30 min（37） ， 0.01 mol/L 硼酸液中和 10 min，浸入含 0.3 g/L Triton X100 的 0.01 mol/L KPBS 30 min 后，首先入 1100小鼠抗兔 sarcomeric actin 抗体 4 孵育 24 h 后，0.01 mol/L KPBS 漂洗，然后入 1100 的 FITC 标记的 antiBrdU 抗体及1100 的 Cy3 标记的
13、羊抗小鼠 IgG (1200 的 TRITC 标记的羊抗小鼠 IgG)，避光孵育 4 h，漂洗后缓冲甘油封片，激光共聚焦显微6镜观察.1.2.2Western blot 分析取心肌梗死区的组织，在-80和37之间反复冻融 6 次，移入 1.5 mL Ep 管中，4 ，14 800 g 离心 15 min，取上清. 用 100 g/L 的 SDSPAGE 胶分离蛋白质，Bradford 法蛋白定量后，均取 20 g 总蛋白行 120 g/L SDSPAGE凝胶电泳，电转移于 NC 膜上，加入一抗 VEGF (11000, Chemicon), bFGF (11000, Santa Cruz)，4
14、过夜. PBST 洗膜15 min1. 将膜装入塑料袋中，加入用 PBST 稀释羊抗小鼠IgG（ 11000） ， 37 1 h. PBST 洗膜 15 min3. 放射自显影：按照 ECL 试剂盒(Amersham 公司)说明进行，观察照相.1.2.3ELISA 法测定局部心肌组织中 VEGF 的表达将局部心肌组织匀浆后以 24 800 g 离心. 用 ELISA 试剂盒(Santa Cruz)检测心肌组织中 VEGF 的表达.1.2.4 梗死区血管数目的检测切片经过免疫组化染色血管标志物凝血因子. 采用 SABC 免疫组化法染色（武汉博士德） ，组织切片加入小鼠抗因子 mAb (Dako)
15、在 4过夜，加入生物素标记的羊抗小鼠 IgG 37 孵育 1 h，再滴加 SABC，37 孵育 1 h，最后用 DAB 显色，苏木素复染. 经过免疫组化染色的微血管呈棕黄色，为了量化缺血区的血管数量，每只动物取 10 张切片，每张切片随7机取 3 个 200视野，进行血管记数. 凡是免疫组化凝血因子染色成棕黄的 2 个或 2 个以上内皮细胞簇均作为 1 个血管记数.统计学处理：所有资料用 xs 表示，由 SPSS 10.0 软件包处理. 两组间比较采用 t 检验，不同时间点超声观察指标的比较采用重复测量资料的方差分析，P0.05 为有统计学意义 .2 结果在原代培养的 MSC 中，多数为成纤维
16、样的梭形细胞，偶有宽阔、平坦的多边形细胞，初始细胞呈团簇生长，向四周发散. 经换液培养后，造血细胞基本消失，贴壁细胞体积较大，均为一致的梭形细胞. 随着时间的延长，细胞形成克隆样生长，渐渐铺满整个培养瓶. 传代后生长的细胞形态一致，均为成纤维样的梭形细胞，有时可见细胞融合（图 1A）. 我们用 BrdU 标记准备移植的 MSC. BrdU 在细胞生长的 S 期标记细胞核，可见 BrdU 阳性的细胞核呈现棕黄色，还可见到核分裂像（图 1B）. 移植的 MSC 经过免疫荧光双标法显示 BrdU 及 sarcomeric actin(connexin 43)通过 Western blot 检测分析显示移植 MSC 的心肌组织中VEGF 和 bFGF 表达较对照组高（图 4） ，ELISA 分析显示移植 MSC可促进心肌组织中 VEGF
