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1、微生物涂抹法菌落总数检测作业指导范围：适用于设备、成品面包装容器、塑料薄膜等的微生物检测、菌落总数的测定。1 实验试剂及器材1.1 实验试剂1.1.1 灭菌生理盐水(0.85)称取 8.5g NaCl 溶于 1000mL 蒸馏水，经 121灭菌 20min 后，PH 值应为7.00.1。1.1.2 营养琼脂培养基（平板计数琼脂）：按 GB 4789.28 中 4.7 规定。1.1.3 75乙醇1.2 实验仪器1.2.1 培养箱：3611.2.2 冰箱：041.2.3 恒温水浴：4611.2.4 天平1.2.5 移液管：1mL，5mL，10mL；1.2.6 吸耳球1.2.7 广口瓶或三角瓶1.2
2、.8 培养皿1.2.9 灭菌镊子1.2.10 称量纸1.2.11 硫酸纸、牛皮纸、线1.2.12 脱脂棉球1.2.13 高压灭菌锅1.2.14 放大镜1.2.15 酒精灯2 实验步骤2.1 准备实验2.1.1 将洗净的三角瓶、广口瓶、移液管、镊子、培养皿等一同经 180，75min 灭菌后放入酒精棉球擦拭过的超净台上备用。2.1.2 配制一定量 0.85的生理盐水，分装于广口瓶中，每个广口瓶装 99mL，并给每个广口瓶装一个大约 333cm3 大小的无菌棉球。另配制一定量的营养琼脂培养基（按照营养琼脂培养基外包装标示的浓度配制） ，与生理盐水一起经121，20min（干热 121，30min）
3、灭菌后，放置于超净台，待用。2.1.3 打开超净台及室内紫外灯，灭菌 30min，与上面生理盐水和培养基的30min 灭菌可以同步进行。2.1.4 将灭菌后的生理盐水放置于酒精擦拭后的超净台备用，并将培养基放置于46水浴锅中保温。2.2 样品采集进行实验前须用酒精棉球擦拭双手及无菌台的台面，然后以无菌镊子取蘸有少量灭菌生理盐水的无菌棉球，以无菌操作方式于无菌操作台内反复擦拭包装膜内表面，接触面积视卫生状况约 100200cm 2，然后将擦拭后的棉球迅速装入盛有 99mL 灭菌生理盐水的瓶中，盖上瓶盖，摇匀待用。此过程均应在燃烧的酒精灯前操作，并且无菌镊子在使用前应在酒精灯的火焰上灼烧后才使用，
4、广口瓶盖应在酒精灯的火焰旁打开。2.3 检样稀释及培养2.3.1 以无菌操作方式，用 1mL 灭菌吸管吸取上述稀释液 1mL 于一个灭菌平皿内，每个样做 23 个平皿。移液管使用前也须在酒精灯火焰上灼烧后方可使用，培养皿打开的幅度应尽量小，且在酒精灯火焰旁打开，用移液管向培养皿注入稀释液的过程，要在酒精灯火焰旁进行。2.3.2 稀释液移入平皿后，应及时将凉至 46营养琼脂培养基（可放置于461水浴或培养箱保温）注入平皿约 1520mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有 1mL 灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。2.3.3 待琼脂凝后，翻转平板，置 361温箱内培养 482h
5、。2.4 菌落计数方法做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在计下各平板的菌落数后，用同稀释度的各平板菌落总数求出包装膜单位面积的总菌数。2.5 菌落计数报告2.5.1 样品检测结果表示以“个/m 2”报告。2.5.2 平板菌落数的选择一个稀释度使用 23 个平板，应采用平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2 以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限） ，若仅有一条链可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。2.5.3 菌落数的报告菌落总数在 100 以内时，按其实有数报告，大于 100 时，采用二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用 10 的指数来表示。3 微生物涂抹法菌落总数检测流程图预备实验样品采集（涂抹）检样做成几个适当倍数的稀释液选择 23 个适宜稀释度，各以 1mL 分别加入灭菌平皿内每皿加入适量营养琼脂361 482h菌落计数报告
