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1、1基于多尺度发酵生产林可霉素的工艺优化与放大研究一、项目概述1.1 项目提出背景、意义及必要性林可霉素，国外称林肯霉素（Lincomycin，LCM） ，是由美国人 Mason等人于 1962年从尼布拉斯加（Nebraska）林肯市（Lincoln）附近土壤中分离到的一种由林可链霉菌变种所产生的抗生素。林可（肯）链霉菌属于放线菌的一类，它也是一种新的链霉菌菌种。利用该放线菌合成林可霉素的过程中除产生抗菌活性最强的林可霉素 A（简称LCM）外，在一定条件下还产生其 B、C、D、K、S 等类似物。林可霉素(1incomycin)是一种高效广谱抗生素。早期报道林可霉素具有的抗生素间不存在交互抗性，并
2、且毒性很低(Mason and Lewis ,1964)。林可较好的抗革兰氏阳性菌的能力(Lewis et al. 1963)，它与已知霉素被广泛用于由抗革兰氏阳性菌引起的疾病的临床治疗。目前,林可霉素下游产品（如酸克林霉素、克林霉素磷酸脂、克林霉素棕榈酸脂等）的开发和应用相当活跃，林可霉素在国内外的销量大，近年来我公司生产的该产品供不应求。我公司从 80年代就开始生产林可霉素，也是国内该产品第一个通过美国 FDA认证的厂家，但由于各方面的原因，发酵生产林可霉素的水平一直不高。目前，我公司生产的林可霉素产品在国内外市场上供不应求。为了提高林可霉素发酵生产水平，为了抓住当前的市场商机，为了全面提
3、升我公司的竞争力，特申报该项目，如能得到重点扶持，项目完成后必将产生重大的经济效益和社会效益。1.2国内外技术现状、专利等知识产权情况分析和我省现有的工作基础1.2.1国内外技术现状、专利等知识产权情况分析(1) 曾经生物反应器技术几乎被国外几家公司垄断，现在国内有关生物反应器产业发2展较快，给国内发酵过程的优化创造了有利条件。我国生物反应器的研究一直受到国家有关部门的重视，在国家攻关计划“七五”、“八五期间先后立项，并集中国内有关单位攻关，解决了在生物反应器研制中的几个关键技术问题，并形成了早期产品。但由于国家攻关计划与产品开发脱节，再由于当时国内配套基础差，以及各种体制和观念上的问题，严重
4、影响产品质量，故长期以来未能在我国形成规模化的产业。我国商品化生物反应器的市场相当大的一部分被几家国外公司占领了，主要有德国 B.Braun、美国 NBS、瑞士 Bio Engineering、荷兰Applikon、日本丸菱以及韩国高百特等，占据了我国市场的 70%左右。近年来，国内有关生物反应器产业发展较快，有关产品生产的公司企业巳达十多家，主要从事一般化的低档产品生产。由于以仿制为主，研制成本和劳动力成本低，虽然产品的标准下降，但能满足一般用户的需要，特别对生物技术产业刚起步的、优化放大要求不高的和资金不足的企业，低价的产品能满足他们的要求，因此已经基本上占领了低价位生物反应器的国内市场。
5、但由于这些企业技术力量以模仿为主，着重于零部件的替换研究以降低生产成本为目标，缺乏生物过程技术的研究力量，缺乏工艺、工程、装备一体化的研究体制，因而不可能与生物技术发展有同步生物反应器的开发能力。此外，也缺乏多学科技术交叉的研究能力，因而只能是简单的外型仿制和跟踪，缺乏创新的自主知识产权产品。为了适应各种生物技术的实验室成果向产业化转化的需要，对生物反应器的性能要求愈来愈高。（2）基于多尺度的发酵过程与优化理论给林可霉素发酵过程的优化提供了新思路基于多尺度理论下的以代谢流分析与控制为核心的发酵过程多参数相关分析方法。这一方法不仅考虑了基因水平、细胞水平微观状态下的生物反应及代谢阻遇机理，而且还
6、考虑到宏观生物反应器尺度对生物发酵过程的影响，把基因水平，细胞水平和生物反应器尺度纳入统一的系统，进行分析和控制。显然这一方法与单一尺度的静态的3分析方法相比，更符合实际，能更好地解决工业化生产中的放大和优化问题。中国科学院院士郭慕孙教授在为本项目参与人张嗣良先生的专著多尺度微生物过程优化作的序中明确指出“生物系统本身属于高度复杂的自组织系统，其特征之一是多尺度结构及其内部的非线性和非平衡作用。 ”“目前使用的基于单一尺度的平均方法，难于反映过程的内在机理，因此预测性差，不易解决定量放大与调控问题。 ”并且认为张嗣良教授的多尺度微生物过程优化理论与技术在分析和有效控制复杂的生物系统方面是一项创
7、举。1.2.2 现有工作基础我公司有 40多年的盐酸林可霉素发酵的生产历史,有先进的厂房设备,有完善的水、电、气等公用系统，有一支多年从事发酵生产研究的技术队伍，有一整套用于生化工程研究的仪器设备，除了常规的实验仪器设备如 HPLC、摇床、离心机等外，还具有完成本项目研究所需要的设备与配套仪器，其中主要有 FUS-50L新概念发酵罐，该设备用于发酵过程分析与控制，该反应器实现了在线的多参数采集与分析，如温度、搅拌转速、pH、溶解氧浓度（DO）等的测量与分析，同时还配置了称重系统和全自动补料系统，如高如基质、前体、油、酸碱物的自动流加与控制。除上述优点外，该反应器配套的软件包 Bioradar及
8、 Biostar 1.5在国内外相同发酵控制中处于领先水平，同时为远程通讯在异地进行数据传送和分析提供了极大方便。我公司十分重视人才培养和产、学、研结合，去年分别与华东理工大学和江西师范大学签立了关于林可霉素发酵过程的优化、林可霉素高产菌株的筛选项目，经过合作研究，有些方面取得了突破性进展，为我公司后续项目的研究打下了深厚的基础。1.3 国内外技术发展趋势林可霉素是于1962年从链丝菌( Streptomyces Lineolnensis)变异株的好氧发酵液中获得的抗生素，抗革兰阳性菌.临床上用于肺炎球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌及金黄色葡萄球菌的感染。特别用于严重厌气菌引起的感染及金黄色葡
9、萄球菌骨髓炎，4在许多感染症的治疗中疗效显著。由于其对组织和细胞的穿透力强，应用方便，不需做皮试。林可霉素用药途径较多，副反应较少，控制感染快，是较有前途的一种抗生素。二、技术方案论述2.1 项目的技术关键，包括技术难点、创新点2.1.1 项目的创新点(1)基于多尺度理论下的以代谢流分析与控制为核心的发酵过程多参数相关分析方法在发酵生产林可霉素过程中的具体应用传统的发酵过程优化是以经典动力学为基础、以最佳工艺控制点为依据的静态操作方法。而多尺度微生物发酵过程优化是以活细胞为主体的微生物发酵过程，可分为基因尺度、细胞尺度与生物反应器尺度，是不同尺度的网络状态的输入输出关系，存在着信息流、物质流与
10、能量流。其中跨尺度观察、分析与控制是微生物发酵过程优化的关键。故基于多尺度理论发酵过程优化不仅考虑了基因水平、细胞水平微观状态下的生物反应及代谢阻遏机理，而且还考虑到宏观生物反应器尺度对生物发酵过程的影响，把基因水平、细胞水平和生物反应器尺度纳入统一的系统，进行分析和控制。显然这一方法与单一尺度的静态的分析方法相比，更符合实际，能更好地解决工业化生产中的放大和优化问题。（2）应用软件包 Bio-star 1.5，通过人机界面对发酵过程的相关参数进行实时监测和关联分析，再结合离线测定参数进行综合分析，找出工艺关键调控点，实现发酵过程的全面优化我公司去年与华东理工大学生物工程中心签订了基于多尺度理
11、论发酵生产林可霉素的工艺优化合同，同时派出一批技术骨干到该校进行理论和实验培训，同年 6月购置了 FUS-50L高级全自动控制发酵罐，该反应器是由国家生化工程技术研究中心（上海）设计，由上海国强生化工程装备有限公司组织生产的用于生物过程多尺度研究的新型发酵装置，具有在线参数检测与控制功能。同时，与该反应器配套的软件包5（Bioradar-及 Biostar 1.5）具有适应多种反应器特点，融合多种过程理论和控制理论，便于发酵过程工艺分析和优化操作强大功能。该装置已先后运用于青霉素、红霉素、金霉素、链霉素、鸟苷、肌苷、基因工程白蛋白、基因工程植酸酶、基因工程必特螺旋霉素等产品的发酵生产中，取得了
12、多项成果。通过产、学、研充分结合，现在我们不但在发酵优化理论方面有很大提高，同时在中试研究和 60吨实验罐生产中已将发酵水平提高到一个新的层面，将研究成果运用于生产，已初步实现了发酵工艺的优化。（3）发酵液流场的模拟、60 吨罐搅拌与进气结构的改造和工艺的动态优化相结合发酵过程放大困难的原因就在于放大时不可能同时做到几何相似、流体运动学相似和流体动力学相似。在小试研究中，当某一个对生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败。为此，在发酵过程放大研究时，要在以代谢流分析与控制为核心的发酵实验装置上进行研究，由此可在放大的设备上得到完全相同
13、的反映代谢流等生理数据的变化曲线。以上工作还只是生理代谢参数相似的放大原则，并不足以确定大型发酵罐的几何结构和动力结构等设计参数。因此，将放大规模的状态参数转化为操作或设计参数还需要一个研究过程。 如何在放大的罐体上实现相同代谢流参数的效果，需要生物学、化学工程、机械制造、传感技术、计算机控制技术的综合利用。 （4）将传统的和现代的菌种选育方法充分结合，进行林可霉素高产菌株的筛选2005年 10月，我公司与江西师范大学签订了林可霉素高产菌株的筛选合同，同时派出技术骨干到该单位实验室进行全程跟踪实验，创新点集中在以下几方面：（1） 三重复合诱变技术，采用三种不同的诱变方法分步处理林可霉素产生菌，
14、促使林可霉素产生菌的 DNA多基因位点发生突变，然后采用耐前体物压力梯度筛选方法把高产林可霉素产生菌筛选出来；（2）把三重复合诱变技术和原生质体融合技术结合筛选林可霉素高产稳定菌株。现已取得了良好效果，为生产菌种的稳定和发酵水平的提6高提供了保证。2.1.2 项目的技术难点（1）动力学模型的建立有一定难度，给发酵过程优化和放大及生物仿真造成了一定的障碍发酵过程是一个多因素、动态、非线性的复杂生化过程，由于发酵过程中酶动力学实验研究的困难，以及发酵过程控制中某些动态数（如动力学粘度）据采集和处理的困难，使发酵工业化生产时，基本上不可能建立（个别特殊情况例外）完全的微生物反应动力学与条件参数相关联
15、的模型，这给发酵过程的优化和放大带来了一定的困难。虽然 FUS-50L高级全自动控制发酵罐采用了先进、可靠的传感器，采集了十几个参数，同时具有高精度参数测量和精确的补料系统。Bioradar-及 Biostar 1.5软件包开发了自诊断程序、自适应程序等，保证了系统的稳定、可靠运行，保证了一些数据采集的实时性和关联性。但是，由于发酵生产过程的复杂性和多样性，本调控系统仍然需要根据实际情况，特别是结合林可霉素发酵过程的特点进行一定的修正或改进，同时根据小试、中试和 60吨罐生产实验积累丰富的数据，一方面可建立完善的专家系统，另一方面可建立生物仿真系统，从而实现智能化的发酵过程优化。（2）在生产上
16、实现发酵工艺的实时动态优化也具有一定难度良性的工业化大生产与小试、中试实验是有较大区别的，它是一个集先进管理、规范的工艺操作与相关技术人员对动态发酵过程有较高的认识水平于一体的群体行为。由于目前 60吨罐的多参数采集系统仍然没有建立，同时还存在着其他方面的原因，这样给发酵工艺的实时动态优化造成了较大困难。（3）林可链霉菌属放线菌，而放线菌的生产稳定性一般不好，这样给菌种的选育和保藏提出了很高的要求。菌种筛选的技术关键体现在以下三方面：三重复合诱变处理技术； 耐前体物压力梯度筛选方法；双亲本菌株原生质体融合技术。2.2、项目计划目标及主要研究内容72.2.1主要目标 通过林可霉素高产菌株的筛选和基于多尺度发酵工艺的优化与发达研究，稳步提高林可霉素发酵单位，从全方位提高生产效益和降低产品成本。主要达到以下目标：在 192小时发酵周期内，50L 发酵罐林可霉素发酵单位在 7500u/ml以上；60T 发酵罐发酵水平提高 30%以上，发酵总亿在 360十亿以上；申报关于林可霉素高产菌株和过量生产林可霉素
