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1、1乙肝病毒 PreS1 抗原的临床应用【关键词】 乙肝病毒;,DNA;,PreS1 抗原;,临床意义Clinical application value of HBV PreS1 antigen【Abstract】 AIM: To evaluate the clinical significance of detecting PreS1 antigen of hepatitis B virus (HBV). METHODS: HBsAg positive serum specimens (n=1000) from inpatients and outpatients were collecte
2、d, then detected for PreS1 antigen and HBV DNA by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQPCR). RESULTS: The total PreS1 positive rate was 52.0%, the HBVDNA positive rate was 50.8%, and the HBeAg positive rate was 21.0%. The total positive rate of PreS1 was higher distinctly than that
3、 of HBeAg. The total accordance rate between PreS1 and HBVDNA was 94.4%. CONCLUSION: PreS1 is more sensitive than HBeAg when as a serological index of HBV infection and reproduction. Determination of PreS1 has a great application value in diagnosis and treatment of hepatitis B. PreS1 could be taken
4、as a new serological indicator for infectivity and replication of HBV.2【Keywords】 HBV; DNA; PreS1; clinical significance【摘要】 目的：评价检测乙肝病毒 PreS1 抗原的临床应用价值. 方法：将临床送检的 1000 份乙肝病毒表面抗原（ HBsAg）阳性的血清标本进行 PreS1 抗原检测，同时用 FQPCR 进行HBVDNA 测定. 结果： PreS1 总阳性率为 52.0%，HBVDNA 阳性率为 50.8%，HBeAg 阳性率为 21.0%. PreS1 总阳性率明显
5、高于HBeAg 阳性率. PreS1 与 HBVDNA 的总符合率为 94.4%. 结论：PreS1 抗原作为乙肝感染和复制的血清学指标敏感性高于 HBeAg，对提示乙肝患者的病情发展和转归有重要临床意义. PreS1 可以作为一项新的乙肝病毒复制的传染性指标.【关键词】 乙肝病毒; DNA; PreS1 抗原; 临床意义0 引言随着实验诊断学的发展，乙肝病毒的血清学指标不断得到发展完善，PreS1 作为一项新的乙肝病毒感染的血清学标志物越来越被临床重视. 近年发展起来的荧光定量 PCR 技术(fluorescence quantitative polymerase chain reactio
6、n assay, FQPCR)广泛应用于乙肝病毒 DNA 的测定，为乙肝病毒的感染、复制及具有传染性3提供了最直接的依据. 本研究我们将乙肝病毒表面抗原阳性的血清标本同时进行 PreS1 和 DNA 测定，评价 PreS1 作为一项乙肝病毒新的血清学标志物的临床意义.1 对象和方法1.1 对象将西安交通大学第二附属医院病房和门诊送检的疑诊为乙型肝炎的患者，并要求作乙肝系列检查，经检测 HBsAg 为阳性的血清标本收集，共计 1000（男 585，女 415）份. 年龄178 a. 正常对照组 50(男女各 25)例，年龄 1258 a,来自门诊部正常查体的标本，其乙肝五项标记除表面抗体可为阳性
7、外，其余四项皆为阴性. 所有患者均采集静脉血，血清经分离后及时检验，或分装于高压灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管，于 -20冻存.主要试剂: HBVM 试剂购自上海实业科华生物技术有限公司. 质控血清购自卫生部临床检验中心. PreS1 试剂由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所上海阿尔法生物技术有限公司提供. HBVDNA 试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心生产. 引物为 P1: 5ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TT3；P2: 5ACA GTG GGG GAA AGC CCT ACG AA3. 探针：荧光标记的探针(FProbe)序列为5RTGG CT
8、A GTT TAC AGT GCC ATT TGQ3,R 为报告荧光基团; Q 为表淬灭荧光基团.4主要仪器: 瑞士 Ausbio 生产的“酶免之星”全自动免疫分析仪. 美国 PE 公司生产的 PE5700 全自动实时荧光定量 PCR 扩增仪(包括一台 9600 型热循环仪、荧光光源、检测系统及电脑、应用软件).1.2 方法1.2.1 乙肝病毒血清标志物（HBVM）的检测采用上海实业科华生物技术有限公司生产的 EIA 立可读一步法试剂盒，按照说明书的操作步骤及阴阳性判断标准进行编程，其中，HBsAg,HBsAb,HBeAg 为夹心法，HBeAb 为竞争抑制法，HBcAb为中和抑制法. 运用“酶
9、免之星”全自动免疫分析仪，进行检测，试验结果由仪器自动读出. 每次实验都加作室内质控，确保实验结果准确可靠.1.2.2PreS1 抗原测定按照上海阿尔法生物技术有限公司提供的 ELISA 操作步骤和结果判定方式进行编程，该实验为两步法，采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法，以固相化的人工化学合成的前S1 蛋白 2147aa 肽进行免疫制备前 S1 蛋白单抗捕获标本中的乙肝前 S1 抗原，辣根过氧化酶标记的抗 PreS1 单抗为二抗来检测PreS1 抗原，同样采用全自动免疫分析仪进行检测.51.2.3HBVDNA 测定 FQPCR 反应步骤如下：常规碱裂解法从血清中提取 HBVDNA, 0.2 mL
10、 薄壁反应管中 50 L 反应液含 1.0 mol/L 引物、 0.1 mol/L 的荧光探针(FProbe)，200 mol/L 的脱氧核糖核酸、50 nkat Taq DNA 聚合酶及 1缓冲液. 将待检DNA 样本或标准阳性模板加入后, 放入 PE5700 荧光 PCR 仪,93 2 min 预变性后,按 93 45 s 和 55 60 s,先做 10 个循环，最后按93 30 s 和 55 45 s 反复 30 个循环. 同时用拷贝数为 1105, 1106, 1107, 1108/L 定标液进行扩增，以扩增前后的荧光差值为纵坐标，拷贝数为横坐标，用 ABI7000 自动作标准曲线，由
11、电脑软件自动计算出样本 HBVDNA 初始拷贝数定量结果. 由于PreS1，HBVM 检测结果均为定性结果，因此将 HBVDNA 检测结果用定性方式表示（拷贝数106/L 为阴性， 106/L 为阳性）.统计学处理：采用 SPSS8.0 统计软件 ,计数资料采用 2检验,显著性检验水准为 =0.05.2 结果2.1HBVM 不同组 PreS1 抗原检测在 HBsAg 阳性血清中，PreS1 总阳性率为 52%，而正常对照组 50 例全为阴性，阳性率为0. 说明 PreS1 抗原作为一项 HBV 感染的血清学指标的初步可行性. HBeAg 阳性的 HBVM 第和第组 PreS1 阳性率较高（表
12、1）.62.2HBeAg 阳性组与阴性组 PreS1 抗原检测在上述研究基础上，将 HBeAg 阳性组和阴性组 PreS1 抗原检测结果进行比较，2=98.3，P0.01，差异有统计学意义，HBeAg 阳性组 PreS1抗原检出率明显高于 HBeAg 阴性组( 表 2).HBeAg 和 PreS1 总符合率为 61.6%，说明两者有较好的一致性和相关性，由于 HBeAg 是 HBV 复制活跃和传染性指标，本研究显示两者有很高的阳性符合率，可以把 PreS1 抗原作为判断 HBV病毒复制的血清学指标.表 1HBVM 不同组 PreS1 抗原检测结果略表 2HBeAg 与 PreS1Ag 检测结果
13、略2.3PreS1Ag 检测结果与 HBVDNA 结果 PreS1 测定结果与HBVDNA 结果比较有一定差异 (表 3).表 3PreS1Ag 和 HBVDNA 检测结果比较略从表中可以看出： HBVDNA 的总阳性率为 50.8%， 与PreS1 的总符合率为 94.4%， 两者有很高的一致性,差异有统计学7意义(2=788.8， P0.01). 检测 HBVDNA 作为目前诊断是否具有传染性和病毒处于复制期的金标准， 由于 PreS1 和 HBVDNA 两者之间有极高的相关性和一致性， 所以 PreS1 可以作为一项判断乙肝病毒是否复制和具有传染性的血清学新指标.3 讨论在研究过程中，由
14、于 HBsAg 阴性的血清标本在本实验室从未检测出 HBVDNA 阳性，所以本研究只讨论 HBsAg 阳性标本. 对于单独核心抗体阳性而检测到阳性病毒 DNA 的，经重复稀释标本检测表面抗原，证实为阳性，原倍检测阴性是由于前带现象引起. 目前，国内检测 HBsAg 绝大多数应用 ELISA 中双抗体夹心双位点一步法，当标本中 HBsAg 含量过高时，会因钩状效应出现而引起假阴性1. 由于 HBVM 检测所用的试剂为一步法，抗原抗体反应会产生“钩状效应”而产生假阴性结果，PreS1 抗原检测是两步法，避免了“钩状效应”的产生，同时检测 HBVM、PreS1 能够起到相互提示作用，最大程度减少假阴
15、性结果的产生.乙型肝炎病毒的 PreS1 抗原是由 PreS1 基因编码的外壳表面抗原蛋白成分之一，与 HBV 的组装、分泌和入侵肝细胞密切相关，可作为乙肝病毒活动性复制的指标2. PreS1 抗原的持续存在表明病毒复制和病毒颗粒存在. 我们发现，在 HBeAg 阳性组较阴性组8PreS1 检出率高，表明 PreS1 抗原与 HBeAg 存在密切相关. 本研究证明，HBV 的传染性与乙肝病毒 PreS1 抗原阳性率具有一致性，在 HBVM 中 HBsAg, HBeAg 是 HBV 在进行复制、包装过程中产生的蛋白成分，HBsAg 存在并不一定表示有传染性，而 HBeAg 是HBV 核心内部成分
16、，可作为体内 HBV 处于复制状态的标志.PreS1 不仅是 HBV 感染的标志还是 HBV 复制的依据，在HBV 感染早期既可以检出3 . 从试验结果可以看出，在受检者血清中，部分 HBeAg 阴性，但 PreS1 和 HBVDNA 为阳性，可见，HBeAg 阴性并不意味着乙肝病毒复制的完全终止或病毒血症的消失，所以对于 HBeAg 阴性而 HBsAg 阳性的标本，应该检测 PreS1 抗原和 HBVDNA，来判断是否存在 HBV 感染或复制. PreS1 能够敏感地反映乙型肝炎病毒的复制情况，尤其可以反映 HBeAg 阴性的乙型肝炎患者是否有病毒复制. 在急性乙型肝炎患者中，PreS1 先于 HBVDNA 阴转，提示疾病预后良好 4. 尽管 PreS1 和HBVDNA 有很好的相关性，仍有部分标本 PreS1 抗原阳性而HBVDNA 阴性，说明 PreS1 抗原的检测并不能完全替代 HBVD
