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1、植物组培快繁技术康乃馨植物组织培养实验设计小组成员：陈梅 20141641044 郑莉 20141641002 雷雨田 20141641043 康乃馨植物组织培养一、实验目的掌握植物离体快速繁育原理、方法和完整过程。二、实验原理香石竹 （学名 Dianthuscaryophyllus） 又名康乃馨， 花色艳丽， 开花时间长，装饰效果好，是世界上最畅销的切花之一，具有较高经济价值。由于病毒病侵害，常使植株矮化，花朵变小，花色产生斑点，退色甚至不开花，影响切花产量和质量。通过茎尖分生组织培养，能够获得“无病毒”的健康植株，对于引进的少而新的脱毒种苗，再进行一次茎尖培养，进一步降低基础苗中的病毒含量
2、，并通过组织培养的方法快速繁殖，在短期内，就可以获得大量的脱毒试管苗，使引入材料迅速在生产上推广应用，取得明显的经济效益。三、实验仪器与材料仪器： 超净工作台、酒精灯、电炉、烧杯、玻璃棒、镊子、解剖刀、接种盘、纱布、记号笔、标签纸试剂： 75%乙醇、 0.1%升汞、 无菌水、 MS 培养基、 IAA0.1mg/L、 BA0.5mg/L、 pH5.8-6.0、蔗糖、琼脂材料： 康乃馨带芽外植体材料四、实验步骤（一）培养基的配方1、康乃馨的生芽培养基MS+IAA(0.1mg/L)+BA(2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖 30g/L+琼脂 (8g/L)pH5.8-6.0,配制 300
3、ml,用培养瓶分装 1015 瓶。 另外需要制备无菌水 10 瓶， 培养瓶每人 34 瓶。纱布、碟子若干，后二者分别用报纸包好一同灭菌。2、康乃馨的继代培养基MS+BA(0.3mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖 30g/L+琼脂 (8g/L)， pH5.8-6.0,配制300ml,用培养瓶分装 10-15 瓶。 另外需要制备无菌水 10 瓶， 培养瓶每人 3-4 瓶。纱布、碟子若干后二者分别用报纸包好一同灭菌。3、康乃馨的生根培养基MS+生根培养基为 1/2MS+NAA(0.075mg/L)+蔗糖 (30g/L)+琼脂 (8g/L)，pH5.8-6.0,配制 0.3L，用培养瓶分装 1
4、0-15 瓶。另外，需要制备无菌水 10 瓶，每人 3-4 培养瓶、纱布、碟子若干后二者分别用报纸包好一同灭菌。（二）康乃馨的生芽培养1、无菌操作准备将培养基、无菌水、及各种接种用具放入超净工作台，开紫外灯照射消毒20-30min,开送风开关，关紫外灯，通风 10min 后，打开照明日光灯。洗手、换鞋，换实验服，戴口罩，进入接种室，开启超净工作台。用纱布吸取 75%酒精擦手、擦拭超净台、擦拭培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯，镊子、解剖刀、剪刀等接种工具放入灭菌锅灭菌，待冷却后使用。2、外植体消毒选取康乃馨叶腋间生出的侧芽为外殖体，用自来水冲洗半小时，将材料上的泥土和灰尘及杂质冲洗干净，用解剖刀切取
5、所需组织放入大烧杯中，用 75%的酒精浸泡消毒 30s，用无菌水冲洗 3 次，再将材料移入 0.1%升汞溶液浸泡 10分钟 ,然后在超净台内用无菌水冲洗 6 次。材料消毒完成。3、外植体的制备将消毒好的材料用无菌滤纸吸去多余的水份 ,然后在无菌超净工作台上的接种盘内，借助解剖刀剥离茎尖，剥取茎尖大小通常在 0.3mm 左右。以上操作均需在酒精灯火焰旁进行。4、外殖体接种用灭菌过的镊子将切好的外植体接种到配置好的接种培养基上， 每瓶接 2-3块，每人至少三瓶，可以更多一些。接种培养基为MS+IAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L,PH5.8,蔗糖 3%,琼脂 0.75%。接种完成后盖上瓶盖
6、。贴标签，注明材料名称、接种日期和姓名。5、培养与观察将培养瓶表面用酒精擦拭消毒置于培养室培养。整理、清洁超净工作台。康乃馨的培养条件为温度 25 1 ,一昼夜光照 16h,光照强度 2000lx。经过 10 天左右的培养 ,大部分茎尖开始萌动 ,逐渐长大 ,20 天左右即可长成一小丛植株。定期观察培养情况：包括观察日期、生长情况、以及污染情况等，并做好记录。（三）康乃馨的继代培养1、无菌操作准备将培养基及各种接种用具放入超净工作台，开紫外灯照射消毒 20-30min,开送风开关，关紫外灯，通风 10min 后，打开照明日光灯。洗手、换鞋、换实验服，戴口罩，进入接种室，开启超净工作台，用纱布吸
7、取 75%酒精擦手，擦拭超净台，擦拭培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯。镊子、解剖刀、剪刀等接种工具放入灭菌锅灭菌，待冷却后使用。2、无菌操作接种酒精灯火焰旁打开康乃馨芽苗培养基，用镊子取出康乃馨芽苗，置于无菌接种盘内，用解剖刀将芽苗簇切割成含 23 芽苗 然后切去芽苗的上端。3、培养用灭菌过的镊子将切好的外植体接种到配置好的接种培养基上， 每瓶接 2-3块，每人至少三瓶，可以更多一些。将培养瓶表面用酒精擦拭消毒 置于培养室进行光照培养。整理、清洁超净工作台。4、观察记录定期观察培养情况：包括观察日期、生长情况、以及污染情况等，并做好记录。（四）康乃馨芽苗的诱导生根1、无菌操作准备将培养基及各种接种
8、用具放入超净工作台，开紫外灯照射消毒 20-30min,开送风开关，关紫外灯，通风 10min 后，打开照明日光灯。洗手、换鞋、换实验服，戴口罩，进入接种室，开启超净工作台，用纱布吸取 75%酒精擦手，擦拭超净台，擦拭培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯。镊子、解剖刀、剪刀等接种工具放入灭菌锅灭菌，待冷却后使用。2、无菌操作接种酒精灯火焰旁打开康乃馨培养瓶，用镊子取出康乃馨芽苗置于无菌接种盘，用解剖刀将芽苗的每个小芽分开。用镊子将单个小芽插入生根培养基，每瓶接 3 个。盖上瓶盖，贴上标签，注明材料名称、接种日期和姓名。3、培养将培养瓶表面用酒精擦拭消毒 置于培养室进行黑暗培养。整理、清洁超净工作台。4
9、、观察记录定期观察培养情况：包括观察日期、生长情况、以及污染情况等，并做好记录。（五）缓苗移栽试管苗在移栽前几天一般都需要进行炼苗，让它有个逐步适应环境的过渡阶段。一般方法是先将培养瓶从培养室拿到常温下放置，然后将试管苗容器口上包扎的塞子或纸去掉放置几天， 此时需注意保持空气湿度， 并防止杂菌污染，杂菌容易很快生长而污染试管苗。在去掉封口时采用培养基上加薄层水的处理效果较好，即可提高湿度又可减少杂菌生长，但若放置时间较长则需换水。待试管苗逐步适应外界的光照、 温度和湿度后再进行移栽， 即可提高移栽成活率。( 六 ) 移栽技术移栽时，首先将试管苗从所培养的瓶中取出，取时要用镊子小心地操作，切勿把
10、根系损坏，然后把根部粘附的琼脂漂洗掉，要求全部除去，而且动作要轻，以减少伤根伤苗。 （原因 :琼脂中含有多种营养成份 ,若不去掉 ,一旦条件适宜 ,微生物就会很快滋生 ,从而影响植株的生长 ,甚至导致烂根死亡。 ）移栽前 ,先将基质浇透水 ,并用一个筷子粗的竹签在基质中开一穴 ,然后再将植株种植下去 ,最好让根舒展开 ,并防止弄伤幼苗。种植时 ,幼苗深度应适中 ,不能过深或过浅 ,覆土后需把苗周围基质压实 ,也可只将容器摇几下待基质紧实即可 ,以防损伤试管苗的细弱根系和根毛。移栽时最好用镊子或细竹筷夹住苗后再种植在小盆内 . 移栽后需轻浇薄水 ,再将苗移入高湿的环境中 ,保证空间湿度达 90%以上。五、实验结果与分析1、统计、记录初代培养的诱导率2、统计并总结初代培养基的配制方法和步骤3、统计污染率，并分析污染原因4、记录接种生根率和存活率，总结驯化移栽的方法和步骤
