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1、1,第7章 吸光光度法Spectrophotometry,7.1 概 述,7.2 光吸收的基本规律,7.3 紫外-可见分光光度计,7.5 光度分析法的误差,7.4 光度分析法的设计,2,光的基本性质,光是一种电磁波，具有波粒二象性(真空速度2.99791010cms-1)。光子的能量（E）与光的频率（f）及波长（）关系如下： E = h = h (c/ )根据波长或频率排列，得到如表所示的电磁波谱表。,7.1 概述,3,不同类型的光,单色光（monochromatic light）：具同一波长的光。复合光（multiplex light）：由不同波长组成的光。紫外光（ultraviolet l
2、ight）：波长200400 nm。可见光（visible light）：人眼能感觉到的光，波长在400 750 nm。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的。波段（wave band）：各种色光的波长范围不同。互补色光（complementary color light）：按一定比例混合，得到白光（white light）。,4,物质的颜色与光的关系,完全吸收,完全透过,吸收黄色光,光谱示意,表观现象示意,复合光,5,物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性 吸收作用而产生的。,6,吸光光度法的定义（分光光度法）,吸光光度法(Spectrophotometry)是基
3、于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法、可见及紫外吸光光度法及红外光谱法等。,重点讨论可见光区的吸光光度法,7,吸光光度法特点,灵敏度高。常用于测定试样中质量分数为10-210-5的微量组分，甚至更低。准确度较高。吸光光度法为2%5%。应用广泛。几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用吸光光度法进行测定。仪器简单、操作简便、快速。,8,吸收光谱产生的原理,吸收光谱包括:原子吸收光谱(Atomic absorption spectrum)分子吸收光谱(Molecular absorption spectrum ),原子吸收光谱,由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电
4、磁波而引起的，为线状光谱。,9,由电子能级跃迁而产生吸收光谱能量差在120(eV)，是紫外及可见光谱。,吸收光谱产生的原理,分子吸收光谱比较复杂，呈带状光谱，这是由于分子结构的复杂性所决定的。,分子吸收光谱,UV/Vis Spectrophotometry,Infrared Spectrophotometry,由分子振动能级(能量差约0.05l eV)和转动能级(能量差小于0.05 eV)的跃迁而产生的吸收光谱，为红外吸收光谱。用于分子结构的研究。,10,吸光度（absorbance）,吸收光谱（吸收曲线, Absorption curve）,以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。,最大吸收波长
5、（maximum absorption wavelengh ）：光吸收程度最大处的波长。,紫色KMnO4溶液对波长525 nm附近绿色光的吸收最强，而对紫色和红色的吸收很弱。max=525 nm。,浓度不同，吸收光谱曲线形状相同， max不变，吸光度不同。,例,符合比尔定律的有色溶液稀释时，其最大吸收峰的波长位置吸光光度法中的吸收曲线，描述的关系是,11,7.2 光吸收的基本规律,朗伯-比尔定律（Lambert-Beer law）,透光度(透射比）T（Transmittance）,吸光度A (Absorbance),12,A=lg(I0/It)=lg(1/T)=Kbc,当一束平行单色光通过均匀
6、、非散射的透明吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。,朗伯(Lambert J H)和比尔(Beer A)分别于1760和1852年研究了光的吸收与溶液层的厚度及溶液浓度的定量关系，二者结合称为朗伯-比尔定律，也称为光的吸收定律。,朗伯-比尔定律（Lambert-Beer law）,13,朗伯-比尔定律（Lambert-Beer law）,朗伯-比尔定律是进行定量分析的理论基础。比例常数K与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。,含有多种吸光物质的溶液，由于各吸光物质对某一波长的单色光均有吸收作用，若各吸光物质的吸光质点之间相互不发生化学反应，当某一波长的单色光通
7、过这样一种含有多种吸光物质的溶液时，溶液的总吸光度应等于各吸光物质的吸光度之和。这一规律称吸光度的加和性。,14,朗伯-比尔定律的适用范围,入射光为平行单色光且垂直照射吸光物质为均匀非散射体系吸光质点之间无相互作用辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象发生,在分光光度法中，设入射光的强度为1.0，透射光的强度为0.5，则吸光度为 ?用单色光通过某液层厚度一定的溶液，测得A = 0.6，若将该溶液稀释一倍，其他条件不变，则稀释后该溶液的透过率？在紫外可见分光光度法中，若透过光强度为（I），入射光强度为（I0），则透光度为？,例,15,吸光度A、透射比T与浓度c 的关系,16,摩
8、尔吸收系数(molar absorptivity),当浓度c用molL-1，液层厚度b用cm为单位表示时，K用另一符号来表示。称为摩尔吸收系数，单位为Lmol-lcm-1，它表示物质的量浓度为l molL-1，液层厚度为l cm时溶液的吸光度。,17,桑德尔(Sandell)灵敏度,桑德尔灵敏度S是指当仪器的检测极限A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为gcm-2。S与及吸光物质摩尔质量M的关系为：,18,7.3 紫外-可见分光光度计,光度计的光学系统,19,光度计的部件,用612 V钨丝灯作可见光区的光源，发出的连续光谱在360800 nm 范围内。要求
9、电源电压保持稳定，通常在仪器内同时配有电源稳压器。,光源(light source),单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。滤光片(filter)、棱镜(prism)和光栅(grating)。,单色器(monochromator),20,也称吸收池。用于盛放试液的容器。可见光区测量用光学玻璃池。紫外区测量时使用石英吸收池。 规格：0.5 cm，l cm，2 cm，3 cm和5 cm,光度计的部件,比色皿(cuvette),接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。光电管(phototube)和光电倍增管(photomultiplier)。,检测器( detector),把
10、放大的信号以吸光度A或透射比T的方式显示或记录下来。,显示装置,21,7.4 光度分析法的设计,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,I0,It,参比,样品,未考虑吸收池和溶剂对光子的作用,注意比较,紫外-可见分光光度法,22,显色反应,待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂（color reagent）。,待测物质本身有较深的颜色，可以直接测定。,络合反应是显色的最主要方法,23,显色反应的选择,选择性好，干扰少，或干扰容易消除；灵敏度高，有 色物质的应大于104。有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。有色
11、化合物的化学性质稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定。这就要求有色化合物不容易受外界环境条件的影响。有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，即显色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的吸收峰波长之差(称为对比度)大于60 nm。,24,显色剂,有机显色剂种类繁多。如，磺基水杨酸可与很多高价金属离子生成稳定的有色螯合物，主要用于测Fe3+，1，10-邻二氮菲可用于测微量Fe2+。常用的还有二苯硫腙 ，偶氮胂(铀试剂)，铬天青S ，结晶紫等。,无机显色剂不多，因为生成的络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高。如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒；用H2O2显色测
12、钛等。,可根据需要进行选择,25,显色条件的确定,溶液酸度,溶液酸度影响显色剂的平衡浓度、颜色、被测金属离子的存在状态和络合物的组成。,作pH与吸光度关系曲线确定pH范围,显色剂用量,根据实验结果来确定显色剂的用量,显色时间、温度和试剂等,26,干扰及其消除方法,干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。,试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。,干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。,干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，使显色反应不完全。,27,干扰及其消除方法,控制反应条件。加入掩蔽剂。选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作 用，掩
13、蔽剂以及它与干扰物质形成的络合物的颜色 应不干扰待测离子的测定。用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。选择适当的波长。当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加显色剂的用量来消除干扰。分离。以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法。,常用的消除干扰的方法有以下几种。,28,测量波长的选择,为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光，这称为“最大吸收原则”。,在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时， 则应根据实际需要选择波长。,29,从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0.20.8范围内。思考：
14、为什么？,吸光度范围的选择,可通过控制溶液的浓度或选择不同厚 度的吸收池来实现。,30,试液及显色剂均无色，用蒸馏水作参比溶液。显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。,参比溶液,采用几何尺寸及材料完全相同的比色皿，并以参比溶液来调节仪器的零点，可消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差。,参比溶液选择原则,31,标准曲线的制作,分别测量一系列不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线。,测量待测溶液的吸光度，在标准曲
15、线上就可以查到与之相对应的被测物质的含量。,在选择的实验条件下,32,7.5 光度分析法的误差,朗伯-比尔定律的偏离,在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。,若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。,由于仪器或溶液的实际条件与朗伯-比尔定律所要求的理想条件不一致引起的。,33,朗伯-比尔定律的偏离,1. 非单色光引起的偏离,理想状态: 单色光, 符合定律实际情况: 单色器色散能力的限制和出口狭缝需要保持一定的宽度，目前各种分光光度计得到的都是具有某一波段的复合光。
16、因此：物质对不同波长光的吸收程度不同而引起对朗伯比尔定律的偏离（正负偏离均可能）。,选择性能好的单色器在被测物质的最大吸收处测定选择适当的浓度范围,34,2. 介质不均匀引起的偏离,朗伯-比尔定律的偏离,被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光通过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射现象而损失，使透射比减少，因而实测吸光度增加，便标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。,光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。,35,朗伯-比尔定律的偏离,3. 溶液本身的化学反应引起的偏离,溶液中的吸光物质因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯比尔定律。,要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在,36,朗伯-比尔定律的偏离,
