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1、第十一章 核酸的生物合成,nucleic acid biosynthesis,本章主要内容,DNA的生物合成RNA的生物合成,基 因 (gene)： 为蛋白质或RNA编码的DNA功能片段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息。基 因 组（genome)： 某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部DNA序列。,转录：遗传信息从 DNA传递给mRNA的过程。,基因表达：是指将遗传信息由DNA转录为RNA、再翻译成蛋白质。,翻译：mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程。,中心法则（ central dogma）,1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则。,主要内容 D
2、NA的生物合成 复制 RNA的生物合成 转录,第一节 复制的基本规律,半保留复制复制起始点双向复制半不连续复制,DNA复制的基本原则,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,一 半保留复制的概念,半保留复制semiconservative replication,AGAACTTAG,TCTTGAATC,AGAACTTAG,TCTTGAATC,AGAACTTAG,TCTTGA
3、ATC,亲代,子代,DNA半保留复制实验,含N15-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,DNA半保留复制的实验,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,二、复制的起始点和方向,复制起始点： 染色体上固定的位置，由100200个碱基对组成的一段DNA。方向：单向或双向复制 复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉,复制时双链打开，分开成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形的结构称为复制叉。,原核生物：基因组是环状D
4、NA：只有一个复制起始点DNA被描述为眼睛状。为说明方便而做的图为形。,ori,oriC,真核生物： 染色体DNA有多个复制起始点。 两个起始点之间的DNA片段称为复制子。 复制子是独立完成复制的功能单位。,真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉,真核生物的多复制子复制电镜图,三 半不连续复制（semidiscontinous replication),领头链(leading strand),随从链(lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为前导链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链。领头链连续复
5、制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,冈崎片段： 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。 原核生物: 10002000个核苷酸 真核生物: 100200个核苷酸,半不连续复制动画,DNA复制的酶学The Enzymology of DNA Replication,第二节,DNA复制的体系 底物: dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol) 模板: 解开成单链的DNA母链 引物: 提供3-OH末端的RNA短片断 其他酶和蛋白质因子: 拓扑
6、异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶,一、 复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行 。,二 DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,活性：1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性,1959 年获诺贝尔生理学或医学奖,奥乔亚 科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg,聚合反应机理,聚合反应的特点 以单链DNA为模板 以dNTP为原料 引物提供3-O
7、H 聚合方向为5 3 遵守碱基互补规律,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除引物和突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,（一）原核生物的DNA聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol ,催化DNA聚合,参与DNA损伤的应急状态修复,校读、修复合成、切除引物填补空隙,功能,20,40,400,分子数/细胞,10,1,1,亚基数,+,5 外切酶活性,+,+,+, 5外切酶活性,+,+,+,5 聚合酶活性,pol III,pol II,pol I,E. Coli中的DNA聚合酶,功能：校读，去除RNA引物，填补
8、空隙，参与DNA损伤修复。,DNA-pol ,DNA聚合酶II (DNA-pol II) 具有53的聚合酶活性。 只是在无pol及pol的情况下暂时 起作用。 对模板的特异性不高, 参与DNA损伤 的应急状态修复。,DNA聚合酶III (DNA-pol III)是复制延长中真正起催化作用的酶。由10种亚基组成不对称的聚合体。，亚基组成核心酶，亚基具有53的聚合活性，亚基具有35外切酶活性， 亚基可能起组装作用。,亚基(DNA夹子)能夹稳模板链，负责酶沿DNA模板滑动的作用。其余亚基统称为-复合物, 是DNA夹子加载蛋白。,DNA-pol ,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引
9、发，有引物酶活性。,复制的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,三 复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读 （二）复制的保真性和碱基选择,（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读,1. 遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能。,DNA复制的保真性至少要
10、依赖三种机制,（二）复制的保真性和碱基选择,四 复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一） 解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。,（二） DNA拓扑异构酶(D
11、NA旋转酶）,拓扑异构酶作用特点既能水解 、又能连接磷酸二酯键克服解链过程中的打结、缠绕现象,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。（主要）,作用机制,解旋解链酶类的作用,解链酶,DNA拓朴异构酶,单链DNA结合蛋白 SSB,解开、理顺 DNA链、维持DNA单链状,（三） 引物酶(primase),依赖DNA的RNA聚合酶。可以催化游离NTP聚合。催化RNA引物的生
12、成。,五、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP（NAD+）,AMP,5,3,5,3,在复制中起接合双链中单链缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的功能,DNA生物合成过程The Process of DNA Replication,第三节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,DNA解成单链 由拓
13、扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶 解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,引物体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引物体。,DNA复制示意图,拓扑异构酶,解链酶,5/ 3/,3/ 5/ 3/ 5/,DNA聚合酶,单链结合蛋白,DNA聚合酶,前导链 随后链,DNA连接酶,冈崎片段,引物酶,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学
14、本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成,随从链的合成,复制过程简图,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,E.coli,ori,ter,82,32,ori,ter,SV40,50,0,（三）复制的终止,随从链上不连续性片段的连接,DNA的复制过程,模板DNA解旋与解链，形成复制叉；形成引发体，合成RNA引物；按A=T、G=C碱基配对规则，合成DNA；切除引物、填补空隙；DNA连接酶连接封口，形成长链DNA；,逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四节,逆转录 (reverse transcription) 在逆转录酶的催化下，以RNA为模板合成DNA的过程，又称反转录。,
