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1、1中药泽黄颗粒对糖尿病大鼠肺组织水通道蛋白作者：李敏，李锋，胡波，李军昌，张雅萍，王汉民，张三奇【关键词】 糖尿病；肺/损伤；水孔蛋白类；泽黄颗粒Effect of ZeHuangKeLi on aquaporin1 expression in lung tissues in diabetic rats【Abstract】 AIM： To study the expression and activity of aquaporin1 (AQP1) in pulmonary tissues in diabetic rats after fed ZeHuangKeLi (ZHKL). METHOD
2、S： In 60 SD rats, diabetes mellitus (DM) was induced by highglucose and highlipid diet and intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ). After 2 months, DM rats were chosen and randomly divided into model group, observed group, control group (10 rats per group).After 2 monthtreatment of ZHKL, w
3、e observed the pathologic changes in lungs and detected the expression AQP1 by immunohistochemistry. RESULTS： We observed the thickened basal lamina of pulmonary capillary and increased number of fibres in DM rats. The expression of AQP1 decreased in the model group. Compared with the 2model and con
4、trol groups, the expression of AQP1 increased in the observed group (P0.05). CONCLUSION： AQP1 is decreased in lung tissues in DMinduced microcirculation disorder. AQP1 plays an important role in lung edema in DM rats. ZHKL can regulate the activity of AQP1 to improve the water metabolism of lung tis
5、sue.【Keywords】 diabetes mellitus; lung/injuries; aquaporins; ZeHuangKeLi【摘要】 目的： 研究中药泽黄颗粒对糖尿病（DM）大鼠肺组织水通道蛋白 1（ AQP1）表达的影响. 方法： SD 大鼠 60 只，高糖高脂饲料喂养并用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射制作 DM 大鼠模型,2 mo 后挑选成模大鼠随机分到模型组、观察组、对照组，每组 10 只. 给药 2 mo 后观察肺组织的病理改变并用免疫组化方法检测 DM 大鼠肺组织 AQP1 的表达. 结果： DM 大鼠肺泡间隔及毛细血管壁增厚，模型组肺组织 AQP1 表达下降，观察
6、组较模型组和对照组表达升高（P0.05 ）. 结论： DM 时大鼠肺组织微循环障碍,AQP1 表达下降，提示 AQP1 参与 DM 肺水肿的发生发展，泽黄颗粒可调节 AQP1 表达水平，改善肺组织病理改变. 【关键词】 糖尿病；肺/损伤；水孔蛋白类；泽黄颗粒30 引言糖尿病(diabetes mellitus, DM)可引起脏器的慢性损害和功能异常，主要病理改变为微血管病变. 对 DM 引起肺微血管损害主要是肺脏明显肿胀，组织间大量液体聚集1 ，水通道蛋白家族（AQPs）在 DM 引起微血管并发症发生发展中起重要作用2 . 我们研究的目的是观察中药泽黄颗粒(ZHKL）在 DM 肺组织微血管的病
7、理学改变中的作用和对水通道蛋白 1(AQP1)表达的影响.1 材料和方法1.1 材料 4 周龄雄性 SPF 级 SD 大鼠第四军医大学实验动物中心提供，医动证字 SCK(军)200600160 只, 体质量(16512) g. SPF 级饲养环境，环境温度为 2O25 ，12/12 h 昼夜规律，按每笼 5 只喂养 . 随机分为 DM 模型组（模型组） ，ZHKL观察组（观察组） ，美吡达对照组（对照组）3 组. AQP1 兔抗鼠多克隆抗体购自美国 Chemicon（AB3272 ） ；辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔，北京中杉公司） ；链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sig
8、ma 公司)；ZHKL（丹参、泽兰、黄芪等）西京医院药剂科中药制剂室煎制，浓缩成稠膏后，4储藏备用；4美吡达片（购自上海第十五制药厂）. 1.2 方法1.2.1 造模和给药将 60 只大鼠同时给予进食高胆固醇、高糖混合饲料，即普通饲料中加入 100 g/L 猪油、100 g/L 葡萄糖、10 g/L 胆固醇、20 g/L 蛋黄粉、2 g/L 胆酸钠 . 各组大鼠在高糖高脂饲料喂养 4 wk 后尾静脉注射低剂量 STZ(30 mg/kg)1 次. 注射 1 mo后测定各组大鼠血糖值和尿糖. 挑选血糖值高于 7.8 mmol/L，尿糖阳性者为 DM 大鼠，共选出 DM 大鼠 30 只（成模率 50
9、%）. 随机将 30 只 DM 大鼠分为模型组、观察组、对照组中，每组 10 只. 观察组动物给予 ZHKL 稠膏（浓缩后克含生药 0.0051 g） ，按每日 5.5 g/kg 1 次灌胃（灌胃剂量按大鼠用药剂量为人的 10 倍计算）. 对照组动物给予美吡达（搅碎后蒸馏水溶解，配成 0.5 g/L 浓度） ，按5 mg/kg 剂量每日 1 次灌胃；模型组动物同时给予等剂量生理盐水灌胃. 实验期间，所有动物在同一条件下，室温保持在 2024 ，相对湿度 40%. 模型组、治疗组、观察组动物继续给予高糖高脂饮食，自由饮水.1.2.2 取材至 16 wk 时，各组大鼠禁食 16 h，不禁水后，以2
10、50 g/L 乌拉坦(4 mL/kg)腹腔麻醉后腹主动脉取血 8 mL，加入肝素锂抗凝管中于 4 h 内检测血糖、血肌酐、尿素氮. 开胸充分暴露5手术视野，分离肺组织，将肺组织迅速放入装有 40 g/L 甲醛的瓶中固定. 右肺中、下叶做病理学观察，左肺做免疫组化染色(48 72 h后逐级脱水,常温石蜡包埋, 切片，苏木精伊红染色,光镜下观察). 1.2.3AQP1 免疫组化用 PBS 液冲洗玻片标本 33 min. 随后用 140 的 300 mL/L H2O2. PBS 37 30 min. PBS 液冲洗 33 min. 用含 TritonX 的小牛血清封闭特异部位 37 30 min.
11、PBS 液冲洗 33 min. 样品片加 150 兔抗鼠 AQP1 抗体 50 L 37下密封孵育 30 min. PBS 液冲洗 33 min . 加辣根过氧化酶标记的羊抗兔 IgG 50 L 在 37 下孵育 30 min. PBS 液冲洗 33 min. 加ABC 酶在 37下静置 30 min. PBS 液冲洗 33 min. 硫酸镍胺醋酸缓冲液 50 mL 和 50 mL 蒸馏水溶解 DAB 15 mg 过滤后的溶液混合，加入葡萄糖 200 mg，氯化胺 40 mg，最后放入葡萄糖氧化酶 1 mg 混匀. 2030 min 显色. 最后用蒸馏水冲洗 3 次玻片，存片，观察拍照. 对照
12、片第一抗体用 PBS 液代替,其他步骤同样品片. 肺泡间质中微血管呈现棕黄色为阳性，所有切片放大倍数为 400. 每组随机取 5 只动物，每只动物 AQP1 染色各取 3 张切片，各观察10 个视野，面积为 480 000 mm2，免疫组化结果以单个视野下阳性微血管数表示. 统计学处理：所有定量资料均采用 xs 表示,应用 SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用 SNKq6检验.2 结果2.1 大体观察模型组大鼠精神萎靡、倦怠懒散，体臭难闻，均出现多饮、多食、多尿(“三多一少”) 症状，早期体质量不同程度地有所增加，8 wk 后体质量下降，消瘦，挠痒，毛发粗糙坚
13、硬，尾部发黑、有脱皮现象；后期出现腹胀. 观察组和对照组动物的一般情况较好，体质量比较稳定， “三多一少”症状较模型组动物明显减轻，皮毛较光泽，后期没有观察到腹胀. 对照组、观察组动物各死亡 1 只，模型组动物死亡 2 只.2.2 肺组织的病理学模型组动物肺体积增大，渗出明显 ,肺缘钝圆, 切面质实，包膜下有点、片状出血；观察组和对照组动物较模型组上述病变减轻. 镜下观察,模型组动物见肺泡腔缩小,肺泡数量增多，肺泡隔明显增宽, 成纤维细胞数量增加，毛细血管基底膜增厚，血管扩张淤血，腔内充满红细胞，有较多中性粒细胞浸润(图 1A)；观察组和对照组动物肺组织上述改变减轻(图 1B，C).图 1 各
14、组大鼠肺组织病理切片 HE 400略 2.3 各组动物血糖与生化指标模型组动物血糖，血肌酐7（Scr） ，尿素氮（Bun）值明显上升，呼吸频率明显升高；观察和对照组与模型组动物相比血糖，Scr, Bun 值明显下降（表 1）. 表 1 各组大鼠生化指标（略）2.4 肺微血管内皮 AQP1 表达免疫组化染色显示，肺组织中肺泡周围和支气管周围的毛细血管内皮及肺泡上皮均有 AQP1 阳性染色(棕黄色 )，且毛细血管内皮整个周缘较肺泡上皮阳性染色强. 提示 AQP1 主要表达于肺毛细血管内皮细胞. 模型组、对照组以及观察组相比，不同时间的 AQP1 特异性表达细胞类型保持不变. 模型组 AQP1 在毛
15、细血管内皮细胞表达明显下降(图 2A)，这种减少呈现于全肺均能观察到，非局限于损伤严重部位；观察组 AQP1 已基本恢复正常(图 2B)，与模型组相有显著差异 (P0.05)；对照组未见AQP1 有明显变化（图 2C）.3 讨论糖代谢对肺的影响非常重要. 为肺内磷酸肌酸、三磷酸腺苷、三磷脂腺苷及单磷腺苷等的来源；提供肺表面活性物质的碳分子及氨基酸、蛋白质、脂肪酸和磷脂的底物3. 基础研究表明高糖可以引起肺间质炎症反应，出现肺基底膜增厚和细胞外基质增生，导致肺泡萎缩，肺毛细血管管腔狭窄、通透性增加. 同时糖尿病患者8易反复发生低血糖. 肺脏在高通气时可以增加葡萄糖的摄取和应用,饥饿致低血糖时可以
16、减少葡萄糖的氧化,反复低血糖可产生肺水肿,从而导致肺通气功能及弥散功能障碍4-5.肺泡腔和血管腔间水的快速转运有极其重要的生理功能. 水转运障碍会使肺水液代谢稳态失衡，导致肺水肿. 肺泡内水转运主要有两条途径. 一是伴随钠的主动转运；二是经肺泡上皮上的 AQPs. AQP1 主要表达于肺泡周围的毛细血管内皮细胞，调节肺内毛细血管与肺泡间水通透性. 有资料显示 AQP1 基因敲除小鼠与野生型相比，肺渗透压依赖的被动性水转运被抑制 90%6.本实验模型组大鼠出现精神萎靡、倦怠懒散及“三多一少”症状，后期出现呼吸急促等肺损伤表现. 图 2 各组大鼠肺组织 AQP1 免疫组化染色结果 DAB 400略观察组和对照组动物的一般情况较好， “三多一少”症状较模型组动物明显减轻，后期呼吸较平稳. 模型组动物肺组织病理可见肺体积增大,肺泡隔明显增宽, 肺泡及肺间质有较多中性粒细胞浸润,符合 DM 肺损伤改变. 结果显示，模型
