《5-氮杂2-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对人胃癌 SGC-7901细胞生长、Reprimo基因甲基化水平及表达的影响（毕业设计-老年医学专业）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《5-氮杂2-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对人胃癌 SGC-7901细胞生长、Reprimo基因甲基化水平及表达的影响（毕业设计-老年医学专业）（49页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Chain Reaction 逆 转 录 -聚 合 酶 链 反 应Reaction 甲 基 化 特 异 性PCR英文缩写略语英 文 缩 写 英 文 名 称 中 文 名 称5-AzadC 5-Aza-2-deoxycytidine 5-氮 杂 -2-脱 氧 胞 苷TSA Trichostatin A 曲 古 抑 菌 素 AHDAC Histone deacetylase 组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶HAT Histone Acetyltransferases 组 蛋 白 乙 酰 基 转 移 酶DNMT DNA methyltransferase DNA 甲基转移酶PCR Polymerase
2、Chain Reaction 多 聚 酶 链 式 反 应RT-PCR Reverse Transcription- PolymeraseMSP Methylation-Specific-Polymerase ChaincDNA Complementary deoxyribonucleic acid 互 补 脱 氧 核 糖 核 酸mRNA Messenger Ribonuclease 信 使 核 糖 核 酸Rpm Revolutions per minute 每 分 钟 转 数TBS Tris-Base Saline Tris 缓 冲 盐 水bp base pair 碱 基 对Reprimo R
3、eprimo gene Reprimo 基因CpG Cytosine phosphate Guanosine 胞 嘧 啶 鸟 嘌 呤 二 核 苷 酸dNTP Deoxyribonuceoside triphosphate 脱 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸SPSS Statistical package for the social sciences 社 会 科 学 统 计 软 件 包DMSO Dimethyl Sulfoxide 二 甲 基 亚 砜DEPC Diethyl pyrocarbonate 焦 碳 酸 二 乙 酯SDS Sodium dodecyl sulfate 十 二 烷 基
4、磺 酸 钠15-氮杂 2-脱氧胞苷联合曲古抑菌素 A 对人胃癌SGC-7901 细胞生长、 Reprimo 基因甲基化水平及表达的影响摘 要目的 : 目 前 胃 癌 为 全 球 第 四 大 常 见 肿 瘤 ， 占 肿 瘤 相 关 死 亡 原 因 第 二 位 。 由 于 对 胃癌 危 险 因 素 认 识 地 增 加 ， 近 几 十 年 全 球 胃 癌 发 生 率 在 快 速 降 低 ， 但 是 胃 癌 仍 旧 是一 个 沉 重 的 负 担 ， 特 别 像 中 国 这 样 的 发 展 中 国 家 。 胃 癌 被 认 为 是 通 过 多 个 基 因 和表 观 遗 传 学 改 变 积 累 导 致 癌
5、基 因 功 能 激 活 和 抑 癌 基 因 功 能 失 活 所 导 致 。 现 在 大 量证 据 证 明 除 了 基 因 改 变 ， 表 观 遗 传 学 改 变 在 肿 瘤 的 发 生 和 发 展 中 起 到 了 重 要 的 作用 。 DNA 甲基化和组蛋白乙酰化为表观遗传学改变的主要方面，被认为是抑癌基 因 失 活 的 主 要 机 制 。 本 研 究 主 要 目 的 为 探 讨 5-氮 杂 2-脱 氧 胞 苷 （ 5-AzadC） 、曲 古 抑 菌 素 A（ TSA） 及 二 者 联 合 对 于 人 胃 癌 SGC-7901 细 胞 生 长 及 Reprimo 基因 甲 基 化 水 平 和
6、基 因 表 达 的 影 响 、 并 初 步 探 讨 其 失 活 机 制 。方法 :1） 人 胃 癌 SGC-7901 细 胞 培 养 及 分 组 ： 采 用 体 外 培 养 的 人 胃 癌 SGC-7901细 胞 系 ， 将 实 验 分 为 四 组 ： 对 照 组 ： 未 加 任 何 药 物 组 ； 5-AzadC 组 ： 浓 度 5mol/L； TSA 组 ： 浓 度 300 nmol/L ； 5-AzadC + TSA 组 ： 向 培 养 瓶 内 加 入 5mol/L 的 5-AzadC， 培 养 24 h 后 再 加 入 含 300 nmol/L TSA 的 培 养 液 继 续 培 养
7、。每 组 均 培 养 72 h， 每 24 h 更 换 1 次 培 养 液 。2） MTS： 采 用 MTS 法 测 定 各 药 物 浓 度 梯 度 （ 5-AzadC 浓 度 梯 度 为 0.025, 0.25, 2.5,25, 250 mol/L； TSA 浓 度 梯 度 为 0.0015, 0.015, 0.15, 1.5, 15 mol/L； ） 分 别 干 预24, 48, 60, 72 h 后 对 于 SGC-7901 细 胞 增 殖 的 影 响 。3） 甲 基 化 特 异 性 PCR 法 （ MSP） ： 采 用 MSP 检 测 各 组 药 物 干 预 72 h 后 人 胃 癌S
8、GC-7901 细 胞 Reprimo 基因启动子区甲基化的状态。4） 逆 转 录 PCR（ RT-PCR）：采用 RT-PCR 检 测 各 组 药 物 干 预 72 h 前后人胃癌SGC-7901 细 胞 Reprimo 基 因 mRNA 表达水平。25） Western Blot 法 ： 采 用 Western Blot 方 法 检 测 各 组 药 物 干 预 72 h 前 后 人 胃 癌SGC-7901 细 胞 Reprimo 基因蛋白表达水平。结果 : 1） MTS 方 法 检 测 发 现 5-AzadC 和 （ 或 ） TSA 分 别 作 用 24, 48, 60, 72 h 后均
9、抑 制 细 胞 生 长 ， 两 药 联 合 组 比 单 药 组 抑 制 率 显 著 增 强 （ P1.8 )。DNA 浓度计算公式：D NA 样品浓度 (g/l)=OD260稀 释 倍 数 50/1000；13. 将 剩 余 的 DNA 溶液保存在 -20 冰 箱 中 备 用 。2） DNA 亚硫酸氢钠修饰（D NA 修 饰 纯 化 试 剂 盒 ） ：1. 加 1 ml 的 BF1 到 1 瓶 BF5。充分震荡混匀 2 min， 加 80 l BF6 至 瓶 中 充分 振 荡 混 匀 3 min（ 可 能 有 微 量 BF5 未 溶 解 依 然 存 在 ， 这 是 BF5 正 常 的 溶液 饱
10、 和 现 象 ）；2. 在 每 个 0.2 ml PCR 管中，加入混合 BF1/BF5/BF6 110 l ， 再 加 入 200 ngDNA 并 振 荡 混 匀 。 注 ： 检 查 （ 1） 在 添 加 BF1 溶 液 前 如 果 有 沉 淀 ， 应 先 予以 摇 匀 ； 2） 如 果 DNA 体 积 较 大 ， 浓 度 低 于 10 g/l， 应 先 浓 缩 。 配 好 的BF1/BF5/BF6 混 合 液 可 在 室 温 下 保 存 2 周 。 为 获 得 最 佳 效 果 ， 混 合 溶 液 应立 即 使 用 ；3. 盖 紧 PCR 管 并 将 其 放 置 在 一 个 PCR 仪 中
11、， 95 20 min。 同 时 将 自 旋 柱 放入 收 集 管 中 ；4. 加 入 250 l BF2 至自旋柱中，然后转移到 PCR 管（步骤 2） 的 样 本 至 自旋 柱 ， 12 000 Rpm 离心 30 s， 弃 去 废 液 ；5. 各 自 加 入 200 l 的 90%的 酒 精 ， 12 000 Rpm 离 心 20 s；6. 将 12 l 的 BF3 加 入 1 ml 的 90%酒 精 ， 充 分 混 匀 。 然 后 各 自 加 入 60 l，室 温 放 置 8 min， 12 000 Rpm 离心 20 s， 弃 废 液 ；7. 加 入 200 l 的 90%酒 精 ，
12、 12 000 Rpm 离 心 20 s， 弃 废 液 ， 再 加 200 l 90%酒 精 ， 12 000 Rpm 离心 30 s；8. 将 自 旋 柱 置 入 1.5 ml 的 离 心 管 中 ， 将 20 l 的 BF4 直接加到自旋柱中间的薄 膜 上 ， 12 000 Rpm 离 心 30 s；169. 存 入 -20 冰 箱 备 用 。3） 引 物 设 计用 于 甲 基 化 特 异 性 PCR 的 引 物 均 来 自 于 参 考 文 献 19， 每 管 引 物 ( 1OD/管 )均 按 照 说 明 书 加 入 相 应 体 积 的 高 压 灭 菌 纯 水 ， 室 温 下 溶 解 并
13、分 装 标 记 后 放 于-20 冰 箱 保 存 备 用 。 每 个 反 应 所 涉 及 的 引 物 序 列 ， 退 火 温 度 ， 产 物 大 小 ， 循环 数 见 表 1。4） PCR 扩 增采 用 热 启 动 PCR 方 法 ， 冰 上 配 置 反 应 体 系 ， 预 变 性 10 min 后 ， 加 入 TaqDNA 聚合酶，3 6 个 循 环 后 72 延 伸 10 min。具体操作步骤如下：1. 冰 上 配 置 反 应 体 系 25 ul： 按 照 由 多 到 少 的 顺 序 依 次 将 以 下 各 成 分 加 到一 个 0.2 ml 无 菌 EP 管 中 ；反 应 体 系 如 下
14、 （ 冰 上 操 作 ） ：10Taq Buffer 2.0 l25 mmol MgCL2 1.5 ul10 mmol dNTP 0.5 l上 游 引 物 1 l下 游 引 物 1 lDNA 模 板 3 l双 蒸 水 补 足 至 20 l2. 上 述 液 体 充 分 混 匀 后 ， 将 PCR 反 应 管 在 离 心 机 上 短 暂 离 心 去 除 管 壁 上水 珠 后 放 入 PCR 仪 中 ， 95 预 变 性 10 min 后 ， 取 出 PCR 反 应 管 ， 置于 冰 上 5 min。3. 向 上 述 每 个 PCR 反应管中加入以下混合液 5 l（ 冰 上 操 作 ） ：10Taq
15、 Buffer 0.5 l双 蒸 水 3.5 lTaq DNA 聚 合 酶 （ 1U/1） 1 l4. 用 移 液 枪 向 每 个 PCR 反 应 管 中 加 入 5 l 混 合 液 ， 吹 打 混 匀 后 放 置 予PCR 仪 中 。1745. 设 置 循 环 参 数 ：95 30 s56 30 s72 30 s36 个 循 环72 延 伸 10 min4 暂 停表 1 Reprimo 基因甲基化和非甲基化引物序列和 PCR 反 应 条 件Tab1methylation and unmethylation primer sequence of Reprimo gene and reaction conditionsof PCR基 因 正 向 引 物 （ 5-3） 反 向 引 物 （ 5-3） 产 物 （ bp） 退 火 温 度 循 环 数Reprimo M GCGAGTGAGCGTTTAGTTC TACCTAAAACCGAATTCATCG 112 56 36U TTGTGAGTGAGTGTTTAGTTTG TAATTACCTAAAACCAAATTCATC 112 56 36M:甲 基 化 特 异 性 引 物 ； U： 非 甲 基 化 特 异 性 引 物M： methylated speci
